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摘 要：为了解中华鳖胚胎的发育及稚鳖雌雄分化的性状特征，通过监测胚胎重随着孵化时间、质量和稚鳖外形形态的变化，采用相关分析和通径分析法，分析了胚胎性状与质量的关系，建立回归方程。在胚胎生长发育过程中对稚鳖的背甲长、宽和头长等部位生长数据进行了测量统计，结果表明，背甲长、宽和头长与胚胎重呈显著正相关关系；从外观观察稚鳖性别差异明显，根据外观性状参数进行验证分析，正确率达89.5%。
关键词：中华鳖；胚胎发育；稚鳖；雌雄分化
中图分类号 Q954.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）12-0100-3
Development of Embryos in Juvenile Soft-shelled Turtles and Observation of Their Male and Female Differentiation
Wang Jiajia1，2 et al.
（1 Fishery institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031，China；2 Anhui Engineering Research Center for turtle Farming Technology，Bengbu 233000，China）
Abstract：In order to know racteristics of the embryo development and the male and female differentiation of the juvenile soft shelled turtle， the relationship between the embryo character and the quality of the juvenile soft shelled turtle was analyzed by monitoring the changes of the quality of the embryo weight and the shape of the juvenile soft shelled turtle， and the regression equation was established by the correlation analysis and the path analysis. The growth data of the back length and head length of the juvenile soft shelled turtle were measured and analyzed. The results showed that the length and width of the back length， and the head length had a significant positive correlation with the weight of the embryo. From the appearance， the sex differences of juvenile soft shelled turtle were obvious， and the accuracy rate was 89.5% according to the appearance parameters.
Key words：Embryo；Embryonic development；Juvenile soft shelled turtle；Male and female differentiation
中華鳖（Embryo），又名甲鱼、团鱼等，卵生两栖爬行动物，具有重要的研究价值，广泛分布于东南亚各国。在我国，除新疆、西藏、青海外，其它各省均有分布。自然条件下鳖卵孵化率低，人工孵化可提高其成活率。孵化过程中，蛋壳向胚胎提供多种无机盐，卵黄提供有机物和无机物，当胚胎生长速度或者孵化期长时，孵化出壳后，剩余的可利用卵黄很少，卵黄是中华鳖开口之前的能源，卵黄剩余多，有助于提高存活率。温度除了能够影响中华鳖性腺发育，还能影响发育过程中的能耗，温度过高，导致胚胎发育能耗过高；温度过低，孵化期长，总能耗增加[1]。朱阿莉等还发现，在低温下孵化出的稚鳖活动力较弱，放入水中后，需要多次用手触碰驱赶才会游动，而且游泳能力较弱，易死亡[2]。中华鳖卵能够适应一定的温度变化，最适宜温度是28～32℃，温度过高或者过低都会导致胚胎死亡。但是自然环境下很难模拟中华鳖的适宜温度，本文将在变温条件下，研究中华鳖的胚胎发育过程，以期为中华鳖的孵化形态学方面的研究提供参考。
本研究的主要内容：（1）中华鳖卵在孵化过程中的胚胎质量与性状之间的关系；（2）稚鳖性状与性别之间的关系。
1 材料与方法
1.1 实验材料 实验所用鳖卵均取自安徽省喜佳农业发展有限公司，质量在2.9～4.5g，均重3.7g。游标卡尺为长城精工数显游标卡尺，精确到0.01mm。电子秤为上海越平科学仪器，精确到0.01g。
1.2 实验方法 以蛭石为孵化介质，室温下孵化，温度变化范围23～30℃，湿度范围70%～80%。测量方法根据行业标准SC/T 1108-2011，头宽为头部最宽处，背甲长为背甲前缘至后缘的直线距离，背甲宽为背甲左右两侧的直线距离。自观察到胚胎之日起，每隔2d解剖观察，直至孵化出壳。胚胎发育过程采用体式显微镜进行观察，数据采用SPSS 20.0进行分析。
1.3 数据处理 对所有统计量进行独立样本的T检验、Duncan多重比较、表型相关分析、数量性状对活体质量的通径分析以及决定系数的计算，建立数量性状与活体质量的最优回归方程。 2 结果与分析
2.1 鳖卵外观的变化 刚产下的卵为白色球形，直径在2.5～4cm，产后20h左右，在一端呈现白色圆形的受精斑，称为动物极，而未受精的鳖卵则无该现象出现，这与其他大部分的龟鳖卵的发育相似。赵伟华等认为该现象主要是由于胚盘上行到壳下膜的原因[3]，本文在实验过程中亦发现该现象。发育初期，网状的血管从胚体辐射出来，逐渐观察到胚胎呈月牙形首尾相连，能明显观察到胚胎的跳动。随着胚胎的发育，颜色逐渐加深，至孵化后期，卵已经不能透光，可以明显地看出尿囊动脉和尿囊静脉的血管系统，与胚胎循环相连接。由于尿囊紧贴在多孔的壳膜下面，为正在发育着的胚胎提供O2和排除CO2。中华鳖卵属多黄卵型，蛋白含量少，卵中无蛋白系带，所以在胚胎发育过程中，尽量不要翻动，以保证动物朝向上方，便于获得O2。
2.2 质量随孵化天数的变化曲线 每天称重20颗卵，相对于孵化开始时的质量，卵质量减少5.4%（0.054±0.027）。
以胚胎重和卵重的比值为变量x，以孵化时间为因变量Y，拟合二者之间的关系，如表1所示，拟合的曲线类型中相关系数R2均大于0.8，回归关系均达到极显著水平（p<0.001），说明时间对胚胎和质量比值具有決定性的作用，因在孵化过程中质量变化较少，表明时间对胚胎的质量起主要作用。根据表1中拟合的6种类型，发现三次曲线模型的R2最大，但是三次函数的系数较小，可忽略不计。故选用二次曲线模型：Y=-2.139+0.111x-0.001x2。
从表2可以看出，背甲长、宽和头长、宽与胚胎重均正相关，其中背甲宽对胚胎重的影响最为明显，相关性均达到极显著水平（Pearson相关系数最大，p<0.01）。
2.3.2 通径分析 采用Kolmogorov-Smirnov Test 和Shapiro-Wilk Test对胚胎重进行正态性检验，Kolmogorov-Smirnov Test适用于大样本的检测，Shapiro-Wilk Test适用于小样本检测，本研究的样本量为15个，因此对胚胎重进行Shapiro-Wilk Test检验。如表4所示，Shapiro-Wilk的统计量为0.879，显著性水平0.154>0.05，符合正态分布，可进行回归分析。
使用SPSS建立胚胎重与表型参数的回归方程
Y=-7.422-89.343PSL/CL+20.232CW/CL，对各系数进行显著性检验，PSL/CL和CW/CL对胚胎重的影响均达到显著性水平（P<0.05），达到极显著水平。
2.4 性别判定 如图1所示，雌雄稚鳖在外观上最明显的差异为尾巴的长短，雄性尾部超出裙边，尾巴尖而长，雌性尾巴较短，不漏出裙边，尾巴短而软。实体生物显微镜下可观察到，最初的生殖腺位于腹腔后部脊柱两旁，肾脏的腹方前外侧，肠道的背方，呈短细管状，表面光滑，无色胶状透明。外形上早期的精巢和卵巢无区别， 随着胚胎的逐步发育，生殖导管在实体显微镜下清晰可辨，精巢向后与附睾延伸形成的输精管直接相连，输卵管在卵巢的外侧呈细管状且明显。这与朱道玉观察的一致[4]。
3 结论
中华鳖的受精卵为白色球形，孵化初期，一端呈现白色圆形的动物极，胚胎发育过程中，颜色不断加深，动物极需朝上保证O2供给。研究结果表明，胚胎重和卵重的比值与孵化时间的关系符合二次曲线模型：Y=-2.139+0.111x-0.001x2。稚鳖的吻突、背甲长、宽对胚胎重的影响均达到均显著性水平。出壳后的稚鳖雄性尾部超出裙边，雌性尾巴较短，不漏出裙边。通过性状参数对性别进行判别，89.5%的分类正确。
参考文献
[1]杜卫国，计翔.孵化温度对中华鳖胚胎物质和能量利用的影响[J].动物学报，2001（05）：512-517.
[2]朱阿莉，史燕，朱新平，等.温度对中华鳖胚胎发育和初生幼体形态特征及活动能力的影响[J].基因组学与应用生物学，2013，32（03）：303-307.
[3]赵伟华，朱新平，魏成清，等.黄喉拟水龟胚胎发育的观察[J].水生生物学报，2008（05）：649-656.
[4]朱道玉.中华鳖性腺的发生与发育研究[J].水生生物学报，2009，33（05）：924-930.
（责编：王慧晴）
关键词：中华鳖；胚胎发育；稚鳖；雌雄分化
中图分类号 Q954.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）12-0100-3
Development of Embryos in Juvenile Soft-shelled Turtles and Observation of Their Male and Female Differentiation
Wang Jiajia1，2 et al.
（1 Fishery institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031，China；2 Anhui Engineering Research Center for turtle Farming Technology，Bengbu 233000，China）
Abstract：In order to know racteristics of the embryo development and the male and female differentiation of the juvenile soft shelled turtle， the relationship between the embryo character and the quality of the juvenile soft shelled turtle was analyzed by monitoring the changes of the quality of the embryo weight and the shape of the juvenile soft shelled turtle， and the regression equation was established by the correlation analysis and the path analysis. The growth data of the back length and head length of the juvenile soft shelled turtle were measured and analyzed. The results showed that the length and width of the back length， and the head length had a significant positive correlation with the weight of the embryo. From the appearance， the sex differences of juvenile soft shelled turtle were obvious， and the accuracy rate was 89.5% according to the appearance parameters.
Key words：Embryo；Embryonic development；Juvenile soft shelled turtle；Male and female differentiation
中華鳖（Embryo），又名甲鱼、团鱼等，卵生两栖爬行动物，具有重要的研究价值，广泛分布于东南亚各国。在我国，除新疆、西藏、青海外，其它各省均有分布。自然条件下鳖卵孵化率低，人工孵化可提高其成活率。孵化过程中，蛋壳向胚胎提供多种无机盐，卵黄提供有机物和无机物，当胚胎生长速度或者孵化期长时，孵化出壳后，剩余的可利用卵黄很少，卵黄是中华鳖开口之前的能源，卵黄剩余多，有助于提高存活率。温度除了能够影响中华鳖性腺发育，还能影响发育过程中的能耗，温度过高，导致胚胎发育能耗过高；温度过低，孵化期长，总能耗增加[1]。朱阿莉等还发现，在低温下孵化出的稚鳖活动力较弱，放入水中后，需要多次用手触碰驱赶才会游动，而且游泳能力较弱，易死亡[2]。中华鳖卵能够适应一定的温度变化，最适宜温度是28～32℃，温度过高或者过低都会导致胚胎死亡。但是自然环境下很难模拟中华鳖的适宜温度，本文将在变温条件下，研究中华鳖的胚胎发育过程，以期为中华鳖的孵化形态学方面的研究提供参考。
本研究的主要内容：（1）中华鳖卵在孵化过程中的胚胎质量与性状之间的关系；（2）稚鳖性状与性别之间的关系。
1 材料与方法
1.1 实验材料 实验所用鳖卵均取自安徽省喜佳农业发展有限公司，质量在2.9～4.5g，均重3.7g。游标卡尺为长城精工数显游标卡尺，精确到0.01mm。电子秤为上海越平科学仪器，精确到0.01g。
1.2 实验方法 以蛭石为孵化介质，室温下孵化，温度变化范围23～30℃，湿度范围70%～80%。测量方法根据行业标准SC/T 1108-2011，头宽为头部最宽处，背甲长为背甲前缘至后缘的直线距离，背甲宽为背甲左右两侧的直线距离。自观察到胚胎之日起，每隔2d解剖观察，直至孵化出壳。胚胎发育过程采用体式显微镜进行观察，数据采用SPSS 20.0进行分析。
1.3 数据处理 对所有统计量进行独立样本的T检验、Duncan多重比较、表型相关分析、数量性状对活体质量的通径分析以及决定系数的计算，建立数量性状与活体质量的最优回归方程。 2 结果与分析
2.1 鳖卵外观的变化 刚产下的卵为白色球形，直径在2.5～4cm，产后20h左右，在一端呈现白色圆形的受精斑，称为动物极，而未受精的鳖卵则无该现象出现，这与其他大部分的龟鳖卵的发育相似。赵伟华等认为该现象主要是由于胚盘上行到壳下膜的原因[3]，本文在实验过程中亦发现该现象。发育初期，网状的血管从胚体辐射出来，逐渐观察到胚胎呈月牙形首尾相连，能明显观察到胚胎的跳动。随着胚胎的发育，颜色逐渐加深，至孵化后期，卵已经不能透光，可以明显地看出尿囊动脉和尿囊静脉的血管系统，与胚胎循环相连接。由于尿囊紧贴在多孔的壳膜下面，为正在发育着的胚胎提供O2和排除CO2。中华鳖卵属多黄卵型，蛋白含量少，卵中无蛋白系带，所以在胚胎发育过程中，尽量不要翻动，以保证动物朝向上方，便于获得O2。
2.2 质量随孵化天数的变化曲线 每天称重20颗卵，相对于孵化开始时的质量，卵质量减少5.4%（0.054±0.027）。
以胚胎重和卵重的比值为变量x，以孵化时间为因变量Y，拟合二者之间的关系，如表1所示，拟合的曲线类型中相关系数R2均大于0.8，回归关系均达到极显著水平（p<0.001），说明时间对胚胎和质量比值具有決定性的作用，因在孵化过程中质量变化较少，表明时间对胚胎的质量起主要作用。根据表1中拟合的6种类型，发现三次曲线模型的R2最大，但是三次函数的系数较小，可忽略不计。故选用二次曲线模型：Y=-2.139+0.111x-0.001x2。
从表2可以看出，背甲长、宽和头长、宽与胚胎重均正相关，其中背甲宽对胚胎重的影响最为明显，相关性均达到极显著水平（Pearson相关系数最大，p<0.01）。
2.3.2 通径分析 采用Kolmogorov-Smirnov Test 和Shapiro-Wilk Test对胚胎重进行正态性检验，Kolmogorov-Smirnov Test适用于大样本的检测，Shapiro-Wilk Test适用于小样本检测，本研究的样本量为15个，因此对胚胎重进行Shapiro-Wilk Test检验。如表4所示，Shapiro-Wilk的统计量为0.879，显著性水平0.154>0.05，符合正态分布，可进行回归分析。
使用SPSS建立胚胎重与表型参数的回归方程
Y=-7.422-89.343PSL/CL+20.232CW/CL，对各系数进行显著性检验，PSL/CL和CW/CL对胚胎重的影响均达到显著性水平（P<0.05），达到极显著水平。
2.4 性别判定 如图1所示，雌雄稚鳖在外观上最明显的差异为尾巴的长短，雄性尾部超出裙边，尾巴尖而长，雌性尾巴较短，不漏出裙边，尾巴短而软。实体生物显微镜下可观察到，最初的生殖腺位于腹腔后部脊柱两旁，肾脏的腹方前外侧，肠道的背方，呈短细管状，表面光滑，无色胶状透明。外形上早期的精巢和卵巢无区别， 随着胚胎的逐步发育，生殖导管在实体显微镜下清晰可辨，精巢向后与附睾延伸形成的输精管直接相连，输卵管在卵巢的外侧呈细管状且明显。这与朱道玉观察的一致[4]。
3 结论
中华鳖的受精卵为白色球形，孵化初期，一端呈现白色圆形的动物极，胚胎发育过程中，颜色不断加深，动物极需朝上保证O2供给。研究结果表明，胚胎重和卵重的比值与孵化时间的关系符合二次曲线模型：Y=-2.139+0.111x-0.001x2。稚鳖的吻突、背甲长、宽对胚胎重的影响均达到均显著性水平。出壳后的稚鳖雄性尾部超出裙边，雌性尾巴较短，不漏出裙边。通过性状参数对性别进行判别，89.5%的分类正确。
参考文献
[1]杜卫国，计翔.孵化温度对中华鳖胚胎物质和能量利用的影响[J].动物学报，2001（05）：512-517.
[2]朱阿莉，史燕，朱新平，等.温度对中华鳖胚胎发育和初生幼体形态特征及活动能力的影响[J].基因组学与应用生物学，2013，32（03）：303-307.
[3]赵伟华，朱新平，魏成清，等.黄喉拟水龟胚胎发育的观察[J].水生生物学报，2008（05）：649-656.
[4]朱道玉.中华鳖性腺的发生与发育研究[J].水生生物学报，2009，33（05）：924-930.
（责编：王慧晴）