【摘 要】
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目的建立一种以单链抗体为基础的酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）快速检测畜禽产品中西马特罗（cimaterol,CIM）药物残留。方法以重氮化法合成的西马特罗完全抗原CIM-牛血清白蛋白（bovine albumin,BSA）免疫新西兰大白兔,用兔脾细胞总RNA反转录合成c DNA第一链,设计引物扩增兔源抗体重链可变区（heavy ch
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（32102632）； 2018年国家重点研发计划项目（2018YFC1602902）； 河南省科技攻关项目（192102110066）； 河南省高等学校重点科研项目（19A230009）； 新乡市科技攻关项目（GG201901
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目的建立一种以单链抗体为基础的酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）快速检测畜禽产品中西马特罗（cimaterol,CIM）药物残留。方法以重氮化法合成的西马特罗完全抗原CIM-牛血清白蛋白（bovine albumin,BSA）免疫新西兰大白兔,用兔脾细胞总RNA反转录合成c DNA第一链,设计引物扩增兔源抗体重链可变区（heavy chain variable region,VH）和轻链可变区（light chain variable region,VL）,通过45 bp的连接肽（Linker）使用新型重叠延伸聚合酶链式反应技术（splicing by overlap extension polymerase chain reaction,SOE-PCR）连接成VH-Linker-VL并大量制备;利用噬菌体表面展示技术将单链抗体（single-chain variable fragment,Sc Fv）片段与噬菌体展示载体p CANTAB-5e连接,电转化至大肠杆菌TG1感受态细胞,得到兔源噬菌体Sc Fv抗体库。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）判断是否偶联成功,用紫外（ultraviolet,UV）扫描及基质辅助激光解析串联飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption tandem time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）测定人工抗原的偶联比。用ELISA测定免疫兔血清质量。鉴定合成抗体库并对抗体库进行4轮淘选,取最优的CIM-Sc Fv进行氨基酸序列分析。结果CIM-BSA及CIM-鸡卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）偶联比分别为8:1及10:1,免疫血清校价为1:32000,半数抑制浓度为9.77 ng/m L,标准曲线的拟合度为0.997。抗西马特罗兔源噬菌体Sc Fv免疫库的插入率为92%,库容为1×1010 pfu,多样性为83.3%,经淘选获得一株与CIM有结合活性的噬菌体Sc Fv菌。结论西马特罗完全抗原的合成效果良好,可用于建立西马特罗检测方法,兔源噬菌体抗体库为快速获得CIM单链抗体奠定基础,为西马特罗快速检测提供了新思路。
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