【摘 要】
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毕赤酵母是一种甲基营养型酵母,可以利用甲醇作为唯一的碳源和能源,是应用最为广泛的真核外源蛋白表达系统之一。毕赤酵母的甲醇利用率和同化效率较低,高浓度甲醇对细胞有毒性,其中间代谢产物甲醛、甲酸等毒性物质的积累会严重抑制细胞生长,限制目的蛋白的产量。本研究拟在毕赤酵母过氧化物酶体中,利用多酶组装技术在甲醇代谢关键酶之间构建底物通道,减少甲醛积累,增大同化途径通量,提高甲醇耐受性,提高毕赤酵母表达外源蛋
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2018YFA0901500）~~；
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毕赤酵母是一种甲基营养型酵母,可以利用甲醇作为唯一的碳源和能源,是应用最为广泛的真核外源蛋白表达系统之一。毕赤酵母的甲醇利用率和同化效率较低,高浓度甲醇对细胞有毒性,其中间代谢产物甲醛、甲酸等毒性物质的积累会严重抑制细胞生长,限制目的蛋白的产量。本研究拟在毕赤酵母过氧化物酶体中,利用多酶组装技术在甲醇代谢关键酶之间构建底物通道,减少甲醛积累,增大同化途径通量,提高甲醇耐受性,提高毕赤酵母表达外源蛋白能力,获得高效利用甲醇的毕赤酵母人工细胞。研究首先采用双分子荧光互补（BiFC）分析技术验证了多酶组装技术—SpyTag/SpyCatcher体系在毕赤酵母中自组装的可行性,随后利用SpyTag和SpyCatcher成功实现了甲醇氧化酶（AOX）和二羟丙酮合酶（DAS）在胞内自组装形成双酶复合体;在此基础上,引入绿色荧光蛋白EGFP作为报告蛋白,考察表达自组装双酶复合体的重组毕赤酵母利用甲醇进行细胞生长和重组蛋白合成的能力。结果显示,在2%（体积分数）甲醇培养基中,相比原始菌株,表达双酶组装体系的重组菌株的生物量提高了2.3倍,单位D（600）细胞表达的EGFP荧光强度提高了4.51倍,是未组装菌株的2.76倍,EGFP产量约为1.52 mg/mL。
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