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摘要：本文采集化工厂附近被污染土壤，经过富集培养、初筛和復筛，得到一株产耐有机溶剂β-葡萄糖苷酶的革兰氏阳性菌株，并命名为ZXS，经鉴定该菌为Enterobacter cloacae（阴沟肠杆菌）。该菌在温度35 ℃，pH为7.0，DMF含量10%的条件下，β-葡萄糖苷酶活力最高，可达24.7 U/L。
关键词：耐有机溶剂；糖苷酶；筛选；鉴定
中图分类号：Q556 .2 文献标识码：A 文章编号：1003-2177（2018）02-0093-04
糖苷酶（Glycoside hydrolases， GH， EC 3.2.1），又称糖苷水解酶，广泛存在于生物体中[1-2]，在自然界糖苷键的水解过程中扮演着非常重要的角色。糖苷酶作为一类重要的化合物，在食品、医疗、工业等领域都有着十分广泛的利用价值[3-7]。但目前已知存在的糖苷酶大多数都存在酶活力低的问题，且该酶来源十分匮乏。因此，寻找天然产耐有机溶剂糖苷酶的微生物显得尤为重要。本实验采用含有机溶剂的培养基，筛选能产耐有机溶剂糖苷酶的微生物，并对所得微生物进行生物学鉴定，优化产酶条件，为进一步的研究和应用提供酶源和基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要设备与材料
台式高速冷冻离心机，德国希格玛离心机有限公司，singma3K15型；PCR自动系列化分析仪，德国耶拿分析仪，Tpersonal型；琼脂糖水平电泳仪，北京市六一仪器厂，DYCP-32A型。
浙江台州路桥某家化工企业所排污水长期污染过的土样。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、对硝基苯酚-p-D-葡萄糖苷、HEPES。
1.1.2 培养基
富集培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）10.0 g/L，DMF 5%，胰蛋白胨25.0 g/L，酵母提取物3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，K2HPO4 3.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，微量元素液100 mL/L（MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.005 g，CaCl2 0.005g，溶于100 ml蒸馏水中），pH 7.0。
初筛培养基：将富集培养基中的胰蛋白胨替换成 （NH4）2SO4 5.0 g/L。
复筛液体培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）10.0 g/L，蛋白胨 3.0 g/L，酵母提取物2.0 g/L，DMF 5%，（NH4）2SO4 5.0 g/L，NaCl 5 g/L，K2HPO4 3 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，微量元素溶液100 mL/L，pH 7.0。
1.2 方法
1.2.1 富集培养
将采集的土壤悬浮在装有90 mL已灭菌的生理盐水的锥形瓶中，在180 r/min，30 ℃条件下的摇床中震荡30 min，取部分菌液转移到富集液体培养基进行培养，然后重复转接2次。
1.2.2 初筛
选择有明显的微生物生长的富集培养液，取部分富集培养液涂布于初筛固体培养基上，30 ℃恒温箱中培养24 h，观察平板上微生物生长情况。
1.2.3 复筛及酶活测定
从初筛培养基中挑取明显生长的单菌落于复筛液体培养基中培养，然后取菌悬液离心收集菌体，再用等体积的50 mM HPPES（pH7.0）缓冲液重悬，制得菌悬液，以对硝基苯酚葡萄糖苷为底物，测其糖苷酶活力大小。
1.2.4 菌种鉴定
分离纯化菌种，观察纯种菌种的菌落形态，包括菌落大小，颜色，湿度，边缘等；用革兰氏染色，用显微镜观察细菌形态；根据试剂盒提取基因组DNA，然后进行PCR扩增（50μl的体系：去离子水21μl，PrimeSTAR MAX Premix 25 μl，基因组1μl，引物pF-rRNA和pR-rRNA各1.5 μl），琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。接着对PCR产物割胶回收，利用割胶回收试剂盒纯化基因组以及回收基因组。最后，进行测序，在基因库进行比对，制作进化树。
2 实验结果与分析
2.1 微生物鉴定
2.1.1 形态鉴定
对微生物进行革兰氏染色，并在显微镜下观察其染色情况以及形态，实验结果如图1所示，微生物革兰氏染色呈紫色，所以该微生物属于革兰氏阳性菌，并且微生物的形态呈杆状，杆状比较短，属于短杆菌类。
2.1.2 分子生物学鉴定
通过提取基因组，再进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后进行割胶回收纯化基因，并将片段收回用于测序。经过序列比对，得出该微生物的生长进化树如图2所示。经过序列比对得出该微生物与Enterobacter cloacae（阴沟肠杆菌）一类序列最为接近。
2.2 微生物产酶性质研究
2.2.1 反应温度对酶活力的影响
对于反应温度进行优化，分别考察了20、25、30、35、37、40 ℃条件下微生物ZXS的产酶活力，每个条件都进行3次平行重复试验。结果如图3（A）所示，随着反应温度的不断升高，该酶活力先升高达到最大值后再降低，其中在温度为35 ℃时产酶效果最佳。
2.2.2 反应体系pH值对酶活力的影响
对于反应体系中的pH进行优化，分别在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的条件下进行考察，每个条件进行3次平行重复试验，再检测微生物ZXS的产酶活力。结果如图3（B）所示，随着pH的变化酶活力也在不断地变化，总体趋势是随着pH的不断增大，酶活力呈现上升趋势，其中pH为7.0和10.0时酶活力达到最高，接近相等，所以该菌株在一定程度上具有耐受碱性能力，并且在pH 5.0～10.0之间时，此酶的催化活力都相对较稳定。 2.2.3 DMF浓度对酶活力的影響
对于反应体系中有机溶剂试剂DMF的含量进行考察，分别选取了不含DMF试剂，含5%、10%、15%、20%DMF的反应体系进行反应，每个条件进行3次平行重复试验，再检测微生物ZXS的产酶活力。结果如图3（C）所示，随着DMF浓度的升高，菌株的产酶性能逐渐减弱，但并没有完全抑制酶活力，所以总体上DMF对该酶的酶活力有一定的抑制作用。
2.2.4 不同有机溶剂对酶活力的影响
对于微生物ZXS的耐有机溶剂性能进行考察，在反应体系中分别含有10%的DMF、二甲基亚砜（DMSO）、无水乙醇的条件下进行催化反应，每个条件进行3次重复试验，再检测微生物ZXS的产酶活力。结果如图3（D）所示，该菌株在相同条件下对二甲基亚砜的耐受力更好，对无水乙醇的耐受力最差。
3 结语
本实验筛选得到1株产耐有机溶剂糖苷酶的微生物，命名为ZXS，属于Enterobacter cloacae（阴沟肠杆菌）类革兰氏阳性菌株。该菌株在无有机溶剂的情况下酶活最高达到40.2U/L。经进一步对其产酶条件的优化，菌株培养8h后，在反应温度为35℃，pH为7.0，DMF含量为5%时，酶活力最高达到25.9U/L。
参考文献
[1]黄红卫，刘艳丽，李春.糖苷酶的研究及其改造策略[J].生物技术通报，2010，（5）：55-60.
[2] Jacobson R， Schlein Y， Eisenberger C. The biological function of sandfly and leishmania glycosidases[J]. Medical Microbiology and lmmunology， 2001， 190： 51-55.
[3] 邵金辉，韩金祥，朱有名，等.β-葡萄糖苷酶在工农医领域的应用[J].生命的化学，2005，5（1）：22-24.
[4] Gautams S， Simon L. Partitioning of β-glucosidase from Trichoderma reesei in poly and potassium phosphate aqueous two-phase systems： Influence of pH and temperature[J]. Biochemical Engineering Journal， 2006， 30： 104-108.
[5] 王华夫，游小青.茶叶中β-葡萄糖苷酶活性的测定[J].中国茶叶，1996（3）：16-17.
[6] Miller G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry，1959，31（3）：426-428.
[7] 周兰兰，李江华，刘龙，等.耐有机溶剂α-葡萄糖苷酶的筛选及转化槲皮苷条件的优化[J].工业微生物，2013， 43（5）：8-12.
关键词：耐有机溶剂；糖苷酶；筛选；鉴定
中图分类号：Q556 .2 文献标识码：A 文章编号：1003-2177（2018）02-0093-04
糖苷酶（Glycoside hydrolases， GH， EC 3.2.1），又称糖苷水解酶，广泛存在于生物体中[1-2]，在自然界糖苷键的水解过程中扮演着非常重要的角色。糖苷酶作为一类重要的化合物，在食品、医疗、工业等领域都有着十分广泛的利用价值[3-7]。但目前已知存在的糖苷酶大多数都存在酶活力低的问题，且该酶来源十分匮乏。因此，寻找天然产耐有机溶剂糖苷酶的微生物显得尤为重要。本实验采用含有机溶剂的培养基，筛选能产耐有机溶剂糖苷酶的微生物，并对所得微生物进行生物学鉴定，优化产酶条件，为进一步的研究和应用提供酶源和基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要设备与材料
台式高速冷冻离心机，德国希格玛离心机有限公司，singma3K15型；PCR自动系列化分析仪，德国耶拿分析仪，Tpersonal型；琼脂糖水平电泳仪，北京市六一仪器厂，DYCP-32A型。
浙江台州路桥某家化工企业所排污水长期污染过的土样。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、对硝基苯酚-p-D-葡萄糖苷、HEPES。
1.1.2 培养基
富集培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）10.0 g/L，DMF 5%，胰蛋白胨25.0 g/L，酵母提取物3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，K2HPO4 3.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，微量元素液100 mL/L（MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.005 g，CaCl2 0.005g，溶于100 ml蒸馏水中），pH 7.0。
初筛培养基：将富集培养基中的胰蛋白胨替换成 （NH4）2SO4 5.0 g/L。
复筛液体培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）10.0 g/L，蛋白胨 3.0 g/L，酵母提取物2.0 g/L，DMF 5%，（NH4）2SO4 5.0 g/L，NaCl 5 g/L，K2HPO4 3 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，微量元素溶液100 mL/L，pH 7.0。
1.2 方法
1.2.1 富集培养
将采集的土壤悬浮在装有90 mL已灭菌的生理盐水的锥形瓶中，在180 r/min，30 ℃条件下的摇床中震荡30 min，取部分菌液转移到富集液体培养基进行培养，然后重复转接2次。
1.2.2 初筛
选择有明显的微生物生长的富集培养液，取部分富集培养液涂布于初筛固体培养基上，30 ℃恒温箱中培养24 h，观察平板上微生物生长情况。
1.2.3 复筛及酶活测定
从初筛培养基中挑取明显生长的单菌落于复筛液体培养基中培养，然后取菌悬液离心收集菌体，再用等体积的50 mM HPPES（pH7.0）缓冲液重悬，制得菌悬液，以对硝基苯酚葡萄糖苷为底物，测其糖苷酶活力大小。
1.2.4 菌种鉴定
分离纯化菌种，观察纯种菌种的菌落形态，包括菌落大小，颜色，湿度，边缘等；用革兰氏染色，用显微镜观察细菌形态；根据试剂盒提取基因组DNA，然后进行PCR扩增（50μl的体系：去离子水21μl，PrimeSTAR MAX Premix 25 μl，基因组1μl，引物pF-rRNA和pR-rRNA各1.5 μl），琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。接着对PCR产物割胶回收，利用割胶回收试剂盒纯化基因组以及回收基因组。最后，进行测序，在基因库进行比对，制作进化树。
2 实验结果与分析
2.1 微生物鉴定
2.1.1 形态鉴定
对微生物进行革兰氏染色，并在显微镜下观察其染色情况以及形态，实验结果如图1所示，微生物革兰氏染色呈紫色，所以该微生物属于革兰氏阳性菌，并且微生物的形态呈杆状，杆状比较短，属于短杆菌类。
2.1.2 分子生物学鉴定
通过提取基因组，再进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后进行割胶回收纯化基因，并将片段收回用于测序。经过序列比对，得出该微生物的生长进化树如图2所示。经过序列比对得出该微生物与Enterobacter cloacae（阴沟肠杆菌）一类序列最为接近。
2.2 微生物产酶性质研究
2.2.1 反应温度对酶活力的影响
对于反应温度进行优化，分别考察了20、25、30、35、37、40 ℃条件下微生物ZXS的产酶活力，每个条件都进行3次平行重复试验。结果如图3（A）所示，随着反应温度的不断升高，该酶活力先升高达到最大值后再降低，其中在温度为35 ℃时产酶效果最佳。
2.2.2 反应体系pH值对酶活力的影响
对于反应体系中的pH进行优化，分别在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的条件下进行考察，每个条件进行3次平行重复试验，再检测微生物ZXS的产酶活力。结果如图3（B）所示，随着pH的变化酶活力也在不断地变化，总体趋势是随着pH的不断增大，酶活力呈现上升趋势，其中pH为7.0和10.0时酶活力达到最高，接近相等，所以该菌株在一定程度上具有耐受碱性能力，并且在pH 5.0～10.0之间时，此酶的催化活力都相对较稳定。 2.2.3 DMF浓度对酶活力的影響
对于反应体系中有机溶剂试剂DMF的含量进行考察，分别选取了不含DMF试剂，含5%、10%、15%、20%DMF的反应体系进行反应，每个条件进行3次平行重复试验，再检测微生物ZXS的产酶活力。结果如图3（C）所示，随着DMF浓度的升高，菌株的产酶性能逐渐减弱，但并没有完全抑制酶活力，所以总体上DMF对该酶的酶活力有一定的抑制作用。
2.2.4 不同有机溶剂对酶活力的影响
对于微生物ZXS的耐有机溶剂性能进行考察，在反应体系中分别含有10%的DMF、二甲基亚砜（DMSO）、无水乙醇的条件下进行催化反应，每个条件进行3次重复试验，再检测微生物ZXS的产酶活力。结果如图3（D）所示，该菌株在相同条件下对二甲基亚砜的耐受力更好，对无水乙醇的耐受力最差。
3 结语
本实验筛选得到1株产耐有机溶剂糖苷酶的微生物，命名为ZXS，属于Enterobacter cloacae（阴沟肠杆菌）类革兰氏阳性菌株。该菌株在无有机溶剂的情况下酶活最高达到40.2U/L。经进一步对其产酶条件的优化，菌株培养8h后，在反应温度为35℃，pH为7.0，DMF含量为5%时，酶活力最高达到25.9U/L。
参考文献
[1]黄红卫，刘艳丽，李春.糖苷酶的研究及其改造策略[J].生物技术通报，2010，（5）：55-60.
[2] Jacobson R， Schlein Y， Eisenberger C. The biological function of sandfly and leishmania glycosidases[J]. Medical Microbiology and lmmunology， 2001， 190： 51-55.
[3] 邵金辉，韩金祥，朱有名，等.β-葡萄糖苷酶在工农医领域的应用[J].生命的化学，2005，5（1）：22-24.
[4] Gautams S， Simon L. Partitioning of β-glucosidase from Trichoderma reesei in poly and potassium phosphate aqueous two-phase systems： Influence of pH and temperature[J]. Biochemical Engineering Journal， 2006， 30： 104-108.
[5] 王华夫，游小青.茶叶中β-葡萄糖苷酶活性的测定[J].中国茶叶，1996（3）：16-17.
[6] Miller G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry，1959，31（3）：426-428.
[7] 周兰兰，李江华，刘龙，等.耐有机溶剂α-葡萄糖苷酶的筛选及转化槲皮苷条件的优化[J].工业微生物，2013， 43（5）：8-12.