目的建立和评价一个新的多重PCR-反向线点杂交技术(RLB)快速同时检测泌尿生殖道沙眼衣原体(Ct)、淋病奈瑟菌(Ng)和3种支原体感染的方法。方法分别选择Ct隐蔽质粒和Ng 16S rRNA基因设计两对特异性引物,以支原体内转录间隔序列(ITS)设计一对支原体属通用引物,生物素标记下游引物。构建三重PCR同时扩增Ct、Ng、解脲脲原体(Uu)、微小脲原体(Up)、人型支原体(Mh)等菌DNA,然后与固定在尼龙膜上的各特异性寡核苷酸探针杂交。并对142份经荧光定量PCR(FQ-PCR)检测Ct和Ng的性病高危人群标本,以及45份经支原体液体培养法鉴定的标本进行检测。结果多重PCR可同时扩增Ct、Ng、Uu、Up和Mh标准菌株DNA,其PCR产物的片段长度为208～408 bp。97份FQ-PCR Ct阳性标本中有93份经多重PCR-RLB检测为Ct阳性,45份FQ-PCR Ct阴性标本中35份多重PCR-RL8阴性。41份EQ-PCR Ng阳性标本中34份多重PCR-RLB Ng阳性,101份FQ-PCR Ng阴性标本中98份多重PCR-RLB阴性。其中36份经多重PCR-RLB检测为混合感染。32份支原体液体培养阳性标本中28份多重PCR-RLB阳性,13份支原体培养阴性标本经多重PCR-RLB检测均为阴性。结论多重PCR-RLB可快速同时检测Ct、Ng、Uu、Up和Mh,为性传播疾病的临床诊断提供了一种可靠的方法。