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摘要：对采集自我国山东、河南、江苏、安徽4省的21株小麦纹枯病菌菌丝中的dsRNA进行了检测，研究了dsRNA条带与菌株菌落形态、生长速度、对小麦的致病力等生物学特性之间的相关性。结果表明，从16个菌株中检测到dsRNA条带，dsRNA的大小和数量存在丰富的多样性。致病力测定结果表明这21个小麦纹枯病菌菌株的致病力差异显著。目前暂未发现小麦纹枯病菌中dsRNA的类型和数量与菌株的菌落形态、生长速度及致病力等性状存在明显的相关性，但是致病力较弱的菌株中dsRNA条带的多样性更丰富。本研究为今后发掘小麦纹枯病菌中的低毒真菌病毒作了初步的探索。
关键词：禾谷丝核菌； dsRNA； 多样性； 致病力
中图分类号： S 435.121.49
文献标识码： A
小麦纹枯病菌即禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis van der Hoeven）属于双核丝核菌的AGDI融合群，能够引起小麦纹枯病（sharp eyespot）及一些牧草的黄斑病（yellow patch）[13]。近些年来，由于全球环境变化、易感小麦品种广泛种植，小麦纹枯病已在欧洲、北美、非洲、亚洲等地大面积传播，引起产量损失及品质降低，严重危害小麦生产[4]。然而目前生产上缺少抗纹枯病的小麦品种，改变耕作措施等方法虽然可减轻病害的危害，但往往难以实现。化学防治是目前主要的防治方法，但防效不够理想及潜在的病原菌抗药性风险等是纹枯病化学防治面临的最主要问题，因此有必要开发新的防治措施。
真菌病毒（mycovirus）是一类在真菌细胞中存在并复制的病毒，自Holling等首次对真菌病毒报道以来，已发现各类丝状真菌及卵菌中普遍含有病毒[68]。目前发现的大多数真菌病毒的基因组为双链RNA（dsRNA），另有少数的为单链RNA（ssRNA），极少数的为DNA[710]。真菌病毒通常不引起寄主真菌明显的表型改变，但也有一些对其寄主能够产生抑制作用，尤其是引起病原真菌致病力的衰退，而这些真菌病毒在植物真菌病害的生物防治中具有一定的应用潜力[7， 911]。利用板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）中的低毒病毒（Hypovirus）控制板栗疫病的危害在欧洲已经获得了成功，而且低毒病毒与板栗疫病菌互作系统已经成为真菌病毒与寄主互作研究的模式系统[1112]。近年来，从核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）中发现了一系列的致病力衰退相关病毒，其中有些种类具有很好的生防效果[910， 1314]。
早在1978年，就有研究者报道在多核的立枯丝核菌（R.solani）一些菌株中存在的dsRNA可以减弱菌株致病力，通过其转移有可能控制田间强毒力菌株[15]。1997年Jian等人从侵染马铃薯的立枯丝核菌AG3融合群菌株中分离到一种3.57 kb的dsRNA病毒M2，能够导致寄主真菌的致病力减弱[16]。M2编码一段754个氨基酸的多肽A（polypeptide A），能够抑制真菌的莽草酸途径（shikimate pathway），从而影响真菌对碳源的利用，减弱寄主真菌的致病力[17]。在多核丝核菌的13个融合群中，全部能检测到dsRNA病毒的存在，虽然有些病毒暂时不能确定是否会对寄主产生影响，但为从中发掘有生防潜力的真菌病毒提供了很好的资源[1821]。但是，关于双核丝核菌中的真菌病毒的研究很少，尤其是在引起小麦纹枯病的禾谷丝核菌中所含dsRNA的情况还很少有研究报道。
本研究对本实验室2009和2010年在江苏、安徽、山东、河南采集并保存的小麦纹枯病菌菌株进行了致病力测定，从中选取致病力强弱不等的21个菌株进行dsRNA的提取检测，以揭示禾谷丝核菌中dsRNA的多样性情况，并研究其与菌株生物学特性之间的关系，期望发现弱毒相关dsRNA病毒，从而为今后小麦纹枯病的生物防治提供新的策略。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
本实验室2009和2010年在山东、河南、江苏、安徽麦田采集、分离的小麦纹枯病菌菌株，并已经过了形态学及分子生物学鉴定。根据致病力强弱选取了21株，分别为：R0904、R1041（江苏盱眙），R0928（河南南阳），R0940、R0942、R0945（安徽蚌埠），R0956、R0959（安徽界首），R09104、R09111（河南信阳），R1002、R1011（江苏姜堰），R0968、R1020、R1030（河南商丘），R1053（江苏高邮），R1056（江苏淮安），R1084（山东菏泽），R1095（山东曲阜），R1090、R10125（山东济宁）。
1.2 菌株的形态学观察及生长速率测定
将菌株活化后，用打孔器打菌碟（d=5 mm），以菌丝面向下转接到PDA平板中央，25 ℃恒温倒置培养8 d，每隔24 h观察各菌株的菌落形态并测量菌落直径，每个菌株3次重复。
1.3 菌株致病力的测定
取清水浸泡2 d后的小麦籽粒，置于三角瓶中高压灭菌（120 ℃，1 h），接入活化后的纹枯病菌菌株，25 ℃静置培养20 d，每隔2 d振摇三角瓶以打碎结块的麦粒。
将小麦品种‘扬麦158’种子播种于装有1 kg无菌土外口径为16 cm的塑料钵中，每钵播25粒，正常栽培管理，待小麦长到三叶期在小麦茎基部接入一粒病麦粒，每个菌株3个重复，接种4周后调查病情。病情调查参照Lipps等人的分级标准并细化为9个等级[2]，根据调查结果计算病情指数，使用DPS 7.05软件对病情指数进行统计分析。
9级法调查纹枯病标准。
0级：无症状；
1级：外层叶鞘变褐或有明显的纹枯病斑，但病斑≤1/2直径；
3级：外层叶鞘有明显的纹枯病斑，病斑>1/2直径，但内层叶鞘无症状； 5级：内层叶鞘变褐或有明显的纹枯病斑，但病斑≤1/2直径；
7级：内层叶鞘有明显的纹枯病斑，病斑>1/2直径，但植株不死苗；
9级：植株死苗。
根据下列公式计算纹枯病病情指数：
病情指数=∑（各级株数×各级代表值）总株数×最高级代表值×100。
1.4 dsRNA的提取和检测
将活化的菌株接种在铺有玻璃纸的PDA平板上，25 ℃培养10 d后，刮取表面菌丝，存放-70 ℃冰箱备用。dsRNA的提取方法参照Robinson和Deacon，并略加改动[21]。具体如下：取大约0.3 g菌丝在研钵中加液氮研成粉末转移到2 mL离心管中，加入650 μL CTAB提取液（2%CTAB：100 mmol/L TrisHCl，pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；1%β巯基乙醇。用前加3.5 μL蛋白酶K使终浓度为100 μg/mL），混匀，置于65 ℃水浴20 min；每管加入650 μL苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），室温振荡10 min，7 500 r/min离心10～15 min；吸取上清液至新的2 mL离心管中，重复上述操作2次，最后一次采用氯仿抽提；取上清液至新的2 mL离心管中，加入用清洗缓冲液（0.05 mol/L Tris， 0.1 mol/L NaCl， 1 mmol/L EDTA， pH 7.0）预平衡好的纤维素粉0.13 g和适量无水乙醇（至终浓度为16%），振荡混匀后冰浴30 min；将纤维素粉溶液振荡混匀后倒入2 mL离心柱中，2 500 r/min离心1 min，弃滤液；加700 μL含16%乙醇的清洗缓冲液，2 500 r/min离心1 min，重复清洗5次；弃滤液，加入400 μL 65 ℃预热的1×STE（0.05 mol/L Tris， 0.1 mol/L NaCI， 1 mmol/L EDTA，乙醇16%，pH 7.0），静置2 min，然后2 500 r/min离心1 min洗脱dsRNA；将收集到的洗脱液转入1.5 mL离心管中，加1/10体积的3 moL/L NaAc（pH 5.2）和2倍体积无水乙醇，-20 ℃沉淀30 min；4 ℃，12 000 r/min离心20 min，弃上清，用100 μL预冷75%乙醇洗涤沉淀2次；放入超净台中风干，加入50 μL dd H2O溶解沉淀，-70 ℃保存备用。
提取到的dsRNA采用DNase I和S1核酸酶（TaKaRa）按照说明书酶解去除其中的DNA和ssRNA。采用含有EB的1%琼脂糖凝胶，上样30 μL在0.5×TBE缓冲液中恒压120 V，电泳1.5 h，在紫外灯下观察电泳结果。
2 结果与分析
2.1 菌株的形态学观察与生长速率的测定
21个供试菌株平均生长速率为（1±0.25）cm/d。不同菌株的培养性状有一定差异，其中R1002具有旺盛的气生菌丝，产菌核较多；R1041生长很快，5 d即可铺满平皿，气生菌丝向空间蔓延，但菌丝稀疏细弱；R0959生长较快，菌丝紧贴培养基表面，气生菌丝很少，少数菌株如R10125、R1053、R0928生长较慢，几乎不产菌核（图1）。而R10125在生长一段时间后，从菌落中心向外的菌丝逐渐致密硬化，气生菌丝很少，几乎不产菌核。不同菌株间的生长速率差异不显著（图2）。
2.2 菌株致病力的测定
21个禾谷丝核菌菌株的致病力如图3所示。不同菌株间致病力差异显著，其中致病力最强的菌株为R1011，病情指数为66.7；致病力最弱的菌株为R1002，病情指数仅为9.6。菌株致病力的强弱没有地域相关性。
2.3 小麦纹枯病菌菌丝中的dsRNA检测
为检验dsRNA的提取效果，首先用菌株R0959和R10125做了预试验。在1%琼脂糖凝胶上的电泳检测结果如图4，粗提取物中除在15 kb左右有一条明显的条带外，在2.5 kb以下的位置有很多弥散的核酸。采用DNase I处理后，这些弥散的核酸仍然存在。再经S1核酸酶处理后这些弥散的条带消失，而且菌株R10125从6.5 kb往下显露出4条明显的条带。结果说明经双酶解之后仍然存在的核酸为dsRNA，而粗提取物中的弥散条带多数是单链的RNA。
从21个菌株中提取并经过DNase I和S1核酸酶双酶解纯化的dsRNA通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明除R1002、R0940、R0968、R09111、R1011看不到明显条带外，其余16个菌株都含有dsRNA，各菌株所含dsRNA条带数量及大小存在明显差异。并且这16株菌都包含一条大于15 kb的dsRNA条带；R1041在10 kb左右有一条带；R1084、R10125、R1095在6.5 kb处有一明显条带；R0928、R1084、R10125在3～1.5 kb之间有3个条带；R0942在2～1.5 kb之间也有清晰的2个条带；此外R09104、R1056在2 kb区域也有dsRNA条带。检测到dsRNA的这些菌株中，最少只有大于15 kb的这一条带，最多如R1084、R10125中可以清楚看到5条带（图5）。
3 讨 论
禾谷丝核菌大多数菌丝为白色，比较粗壮，均匀向外生长，菌丝与培养基贴合紧密，气生菌丝旺盛或较少。不同菌株在菌落形态、菌核产量、色素等培养性状上存在一定差异，某些菌株生长异常。通过菌株的形态、生长速率及致病力测定结果之间的比较，虽然21株禾谷丝核菌菌落形态、生长速率等方面差异不大，但其致病力存在明显差异，致病力分化与地理来源没有明显的关系。形态异常的菌株如R1004、R10125其致病力很弱，并且产色素较多，菌丝呈褐色，产菌核量很少；弱致病力菌株R10125在培养中观察到其生长的某些时期会发生退化，从中心向外菌丝逐渐变得致密，呈花环状，同时生长变缓，颜色加深，气生菌丝很少；通常寄主真菌被弱毒病毒侵染后，其菌落形态常常会发生异常，如菌丝分支增多，生长缓慢，产菌核量减少，致病力较弱等现象[2224]。但R10125的这些性状是否是由dsRNA引起的还有待进一步研究。 真菌中病毒的基因组多是dsRNA和ssRNA，极少数是DNA[79， 11]，无论是dsRNA还是ssRNA病毒，其在复制过程中都会形成dsRNA[25]。dsRNA具有比ssRNA更好的稳定性和可操作性，为我们研究真菌病毒提供了方便。1979年Morris和Dodds成功开发了一种植物或真菌组织中dsRNA的提取方法：将植物或真菌组织破壁，加入去污剂等使蛋白变性，用苯酚氯仿去除蛋白，关键一步是在15%～17%浓度的乙醇中dsRNA能够与纤维素粉结合，通过洗脱除去DNA及单链RNA，从而获得纯化的dsRNA[26]。虽然也有研究者采用LiCl等方法提取dsRNA，但远没有纤维素粉方法简便高效[2728]。本研究采用该方法提取了禾谷丝核菌中的dsRNA，采用两种核酸酶进行了酶解，其中DNase I能够特异性降解单链或双链的DNA，S1核酸酶能够降解单链的DNA或者RNA，也可以降解双链核酸中的单链部分。最终的电泳结果表明我们从禾谷丝核菌中提取到了质量较高的dsRNA（图4～5）。
对21株禾谷丝核菌dsRNA的检测发现，16株dsRNA阳性与5株dsRNA阴性菌株中既有弱致病力菌株，也有强致病力菌株，并且各菌株所含dsRNA的大小与数量具有一定的多样性。所有16株dsRNA阳性的菌株虽然致病力不同但都含有一条大于15 kb的dsRNA，此外3个弱致病力菌株R0928、R1084、R10125谱带中都额外含有2.5 kb、2 kb和1.8 kb 3个条带，但致病力中等的R0942也含有同样大小的条带；而弱致病力菌株R1084和R10125还含有一条6.5 kb的dsRNA条带，说明同一菌株中可能含有多种dsRNA病毒。暂时未发现菌株所含dsRNA条带数目与菌株致病力之间的关系，但是致病力较弱的菌株如R10125、R1084、R0928中dsRNA条带的多样性更加丰富（图5）。自然情况下，禾谷丝核菌很少发生有性世代，一般也不产生无性孢子，其中所含病毒无法进行垂直传播，理论上只能通过菌丝融合进行水平传播，而田间复杂的自然环境又可能会影响其水平传播的效率，因此不同菌株中所含病毒种类可能会形成丰富的多样性。真菌病毒绝大多数对寄主不产生任何影响，只有少数能减弱寄主的致病力，同一病原真菌中含有多种病毒的情况也比较常见[27]。比如在核盘菌菌株Ep1PN中存在大小为6.0 kb、5.4 kb和853 bp的3种dsRNA片段：6.0 kb的条带是核盘菌RNA病毒（SsRVL），5.4 kb的条带是核盘菌致病力衰退相关的ss（ ）RNA病毒（SsDRV），853 bp的条带可能为SsDRV的缺损形式[1314，23]。其中只有5.4 kb片段病毒能够引起宿主真菌的致病力减弱[13，23]。
小麦纹枯病菌中的dsRNA具有丰富的多样性，在进一步的研究中需要对这些条带的核酸序列进行分析，明确其对寄主真菌的生物学特性尤其是致病力的影响，从而为发掘具有生防潜力的弱毒相关真菌病毒提供具有价值的参考。
参考文献
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关键词：禾谷丝核菌； dsRNA； 多样性； 致病力
中图分类号： S 435.121.49
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小麦纹枯病菌即禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis van der Hoeven）属于双核丝核菌的AGDI融合群，能够引起小麦纹枯病（sharp eyespot）及一些牧草的黄斑病（yellow patch）[13]。近些年来，由于全球环境变化、易感小麦品种广泛种植，小麦纹枯病已在欧洲、北美、非洲、亚洲等地大面积传播，引起产量损失及品质降低，严重危害小麦生产[4]。然而目前生产上缺少抗纹枯病的小麦品种，改变耕作措施等方法虽然可减轻病害的危害，但往往难以实现。化学防治是目前主要的防治方法，但防效不够理想及潜在的病原菌抗药性风险等是纹枯病化学防治面临的最主要问题，因此有必要开发新的防治措施。
真菌病毒（mycovirus）是一类在真菌细胞中存在并复制的病毒，自Holling等首次对真菌病毒报道以来，已发现各类丝状真菌及卵菌中普遍含有病毒[68]。目前发现的大多数真菌病毒的基因组为双链RNA（dsRNA），另有少数的为单链RNA（ssRNA），极少数的为DNA[710]。真菌病毒通常不引起寄主真菌明显的表型改变，但也有一些对其寄主能够产生抑制作用，尤其是引起病原真菌致病力的衰退，而这些真菌病毒在植物真菌病害的生物防治中具有一定的应用潜力[7， 911]。利用板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）中的低毒病毒（Hypovirus）控制板栗疫病的危害在欧洲已经获得了成功，而且低毒病毒与板栗疫病菌互作系统已经成为真菌病毒与寄主互作研究的模式系统[1112]。近年来，从核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）中发现了一系列的致病力衰退相关病毒，其中有些种类具有很好的生防效果[910， 1314]。
早在1978年，就有研究者报道在多核的立枯丝核菌（R.solani）一些菌株中存在的dsRNA可以减弱菌株致病力，通过其转移有可能控制田间强毒力菌株[15]。1997年Jian等人从侵染马铃薯的立枯丝核菌AG3融合群菌株中分离到一种3.57 kb的dsRNA病毒M2，能够导致寄主真菌的致病力减弱[16]。M2编码一段754个氨基酸的多肽A（polypeptide A），能够抑制真菌的莽草酸途径（shikimate pathway），从而影响真菌对碳源的利用，减弱寄主真菌的致病力[17]。在多核丝核菌的13个融合群中，全部能检测到dsRNA病毒的存在，虽然有些病毒暂时不能确定是否会对寄主产生影响，但为从中发掘有生防潜力的真菌病毒提供了很好的资源[1821]。但是，关于双核丝核菌中的真菌病毒的研究很少，尤其是在引起小麦纹枯病的禾谷丝核菌中所含dsRNA的情况还很少有研究报道。
本研究对本实验室2009和2010年在江苏、安徽、山东、河南采集并保存的小麦纹枯病菌菌株进行了致病力测定，从中选取致病力强弱不等的21个菌株进行dsRNA的提取检测，以揭示禾谷丝核菌中dsRNA的多样性情况，并研究其与菌株生物学特性之间的关系，期望发现弱毒相关dsRNA病毒，从而为今后小麦纹枯病的生物防治提供新的策略。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
本实验室2009和2010年在山东、河南、江苏、安徽麦田采集、分离的小麦纹枯病菌菌株，并已经过了形态学及分子生物学鉴定。根据致病力强弱选取了21株，分别为：R0904、R1041（江苏盱眙），R0928（河南南阳），R0940、R0942、R0945（安徽蚌埠），R0956、R0959（安徽界首），R09104、R09111（河南信阳），R1002、R1011（江苏姜堰），R0968、R1020、R1030（河南商丘），R1053（江苏高邮），R1056（江苏淮安），R1084（山东菏泽），R1095（山东曲阜），R1090、R10125（山东济宁）。
1.2 菌株的形态学观察及生长速率测定
将菌株活化后，用打孔器打菌碟（d=5 mm），以菌丝面向下转接到PDA平板中央，25 ℃恒温倒置培养8 d，每隔24 h观察各菌株的菌落形态并测量菌落直径，每个菌株3次重复。
1.3 菌株致病力的测定
取清水浸泡2 d后的小麦籽粒，置于三角瓶中高压灭菌（120 ℃，1 h），接入活化后的纹枯病菌菌株，25 ℃静置培养20 d，每隔2 d振摇三角瓶以打碎结块的麦粒。
将小麦品种‘扬麦158’种子播种于装有1 kg无菌土外口径为16 cm的塑料钵中，每钵播25粒，正常栽培管理，待小麦长到三叶期在小麦茎基部接入一粒病麦粒，每个菌株3个重复，接种4周后调查病情。病情调查参照Lipps等人的分级标准并细化为9个等级[2]，根据调查结果计算病情指数，使用DPS 7.05软件对病情指数进行统计分析。
9级法调查纹枯病标准。
0级：无症状；
1级：外层叶鞘变褐或有明显的纹枯病斑，但病斑≤1/2直径；
3级：外层叶鞘有明显的纹枯病斑，病斑>1/2直径，但内层叶鞘无症状； 5级：内层叶鞘变褐或有明显的纹枯病斑，但病斑≤1/2直径；
7级：内层叶鞘有明显的纹枯病斑，病斑>1/2直径，但植株不死苗；
9级：植株死苗。
根据下列公式计算纹枯病病情指数：
病情指数=∑（各级株数×各级代表值）总株数×最高级代表值×100。
1.4 dsRNA的提取和检测
将活化的菌株接种在铺有玻璃纸的PDA平板上，25 ℃培养10 d后，刮取表面菌丝，存放-70 ℃冰箱备用。dsRNA的提取方法参照Robinson和Deacon，并略加改动[21]。具体如下：取大约0.3 g菌丝在研钵中加液氮研成粉末转移到2 mL离心管中，加入650 μL CTAB提取液（2%CTAB：100 mmol/L TrisHCl，pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；1%β巯基乙醇。用前加3.5 μL蛋白酶K使终浓度为100 μg/mL），混匀，置于65 ℃水浴20 min；每管加入650 μL苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），室温振荡10 min，7 500 r/min离心10～15 min；吸取上清液至新的2 mL离心管中，重复上述操作2次，最后一次采用氯仿抽提；取上清液至新的2 mL离心管中，加入用清洗缓冲液（0.05 mol/L Tris， 0.1 mol/L NaCl， 1 mmol/L EDTA， pH 7.0）预平衡好的纤维素粉0.13 g和适量无水乙醇（至终浓度为16%），振荡混匀后冰浴30 min；将纤维素粉溶液振荡混匀后倒入2 mL离心柱中，2 500 r/min离心1 min，弃滤液；加700 μL含16%乙醇的清洗缓冲液，2 500 r/min离心1 min，重复清洗5次；弃滤液，加入400 μL 65 ℃预热的1×STE（0.05 mol/L Tris， 0.1 mol/L NaCI， 1 mmol/L EDTA，乙醇16%，pH 7.0），静置2 min，然后2 500 r/min离心1 min洗脱dsRNA；将收集到的洗脱液转入1.5 mL离心管中，加1/10体积的3 moL/L NaAc（pH 5.2）和2倍体积无水乙醇，-20 ℃沉淀30 min；4 ℃，12 000 r/min离心20 min，弃上清，用100 μL预冷75%乙醇洗涤沉淀2次；放入超净台中风干，加入50 μL dd H2O溶解沉淀，-70 ℃保存备用。
提取到的dsRNA采用DNase I和S1核酸酶（TaKaRa）按照说明书酶解去除其中的DNA和ssRNA。采用含有EB的1%琼脂糖凝胶，上样30 μL在0.5×TBE缓冲液中恒压120 V，电泳1.5 h，在紫外灯下观察电泳结果。
2 结果与分析
2.1 菌株的形态学观察与生长速率的测定
21个供试菌株平均生长速率为（1±0.25）cm/d。不同菌株的培养性状有一定差异，其中R1002具有旺盛的气生菌丝，产菌核较多；R1041生长很快，5 d即可铺满平皿，气生菌丝向空间蔓延，但菌丝稀疏细弱；R0959生长较快，菌丝紧贴培养基表面，气生菌丝很少，少数菌株如R10125、R1053、R0928生长较慢，几乎不产菌核（图1）。而R10125在生长一段时间后，从菌落中心向外的菌丝逐渐致密硬化，气生菌丝很少，几乎不产菌核。不同菌株间的生长速率差异不显著（图2）。
2.2 菌株致病力的测定
21个禾谷丝核菌菌株的致病力如图3所示。不同菌株间致病力差异显著，其中致病力最强的菌株为R1011，病情指数为66.7；致病力最弱的菌株为R1002，病情指数仅为9.6。菌株致病力的强弱没有地域相关性。
2.3 小麦纹枯病菌菌丝中的dsRNA检测
为检验dsRNA的提取效果，首先用菌株R0959和R10125做了预试验。在1%琼脂糖凝胶上的电泳检测结果如图4，粗提取物中除在15 kb左右有一条明显的条带外，在2.5 kb以下的位置有很多弥散的核酸。采用DNase I处理后，这些弥散的核酸仍然存在。再经S1核酸酶处理后这些弥散的条带消失，而且菌株R10125从6.5 kb往下显露出4条明显的条带。结果说明经双酶解之后仍然存在的核酸为dsRNA，而粗提取物中的弥散条带多数是单链的RNA。
从21个菌株中提取并经过DNase I和S1核酸酶双酶解纯化的dsRNA通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明除R1002、R0940、R0968、R09111、R1011看不到明显条带外，其余16个菌株都含有dsRNA，各菌株所含dsRNA条带数量及大小存在明显差异。并且这16株菌都包含一条大于15 kb的dsRNA条带；R1041在10 kb左右有一条带；R1084、R10125、R1095在6.5 kb处有一明显条带；R0928、R1084、R10125在3～1.5 kb之间有3个条带；R0942在2～1.5 kb之间也有清晰的2个条带；此外R09104、R1056在2 kb区域也有dsRNA条带。检测到dsRNA的这些菌株中，最少只有大于15 kb的这一条带，最多如R1084、R10125中可以清楚看到5条带（图5）。
3 讨 论
禾谷丝核菌大多数菌丝为白色，比较粗壮，均匀向外生长，菌丝与培养基贴合紧密，气生菌丝旺盛或较少。不同菌株在菌落形态、菌核产量、色素等培养性状上存在一定差异，某些菌株生长异常。通过菌株的形态、生长速率及致病力测定结果之间的比较，虽然21株禾谷丝核菌菌落形态、生长速率等方面差异不大，但其致病力存在明显差异，致病力分化与地理来源没有明显的关系。形态异常的菌株如R1004、R10125其致病力很弱，并且产色素较多，菌丝呈褐色，产菌核量很少；弱致病力菌株R10125在培养中观察到其生长的某些时期会发生退化，从中心向外菌丝逐渐变得致密，呈花环状，同时生长变缓，颜色加深，气生菌丝很少；通常寄主真菌被弱毒病毒侵染后，其菌落形态常常会发生异常，如菌丝分支增多，生长缓慢，产菌核量减少，致病力较弱等现象[2224]。但R10125的这些性状是否是由dsRNA引起的还有待进一步研究。 真菌中病毒的基因组多是dsRNA和ssRNA，极少数是DNA[79， 11]，无论是dsRNA还是ssRNA病毒，其在复制过程中都会形成dsRNA[25]。dsRNA具有比ssRNA更好的稳定性和可操作性，为我们研究真菌病毒提供了方便。1979年Morris和Dodds成功开发了一种植物或真菌组织中dsRNA的提取方法：将植物或真菌组织破壁，加入去污剂等使蛋白变性，用苯酚氯仿去除蛋白，关键一步是在15%～17%浓度的乙醇中dsRNA能够与纤维素粉结合，通过洗脱除去DNA及单链RNA，从而获得纯化的dsRNA[26]。虽然也有研究者采用LiCl等方法提取dsRNA，但远没有纤维素粉方法简便高效[2728]。本研究采用该方法提取了禾谷丝核菌中的dsRNA，采用两种核酸酶进行了酶解，其中DNase I能够特异性降解单链或双链的DNA，S1核酸酶能够降解单链的DNA或者RNA，也可以降解双链核酸中的单链部分。最终的电泳结果表明我们从禾谷丝核菌中提取到了质量较高的dsRNA（图4～5）。
对21株禾谷丝核菌dsRNA的检测发现，16株dsRNA阳性与5株dsRNA阴性菌株中既有弱致病力菌株，也有强致病力菌株，并且各菌株所含dsRNA的大小与数量具有一定的多样性。所有16株dsRNA阳性的菌株虽然致病力不同但都含有一条大于15 kb的dsRNA，此外3个弱致病力菌株R0928、R1084、R10125谱带中都额外含有2.5 kb、2 kb和1.8 kb 3个条带，但致病力中等的R0942也含有同样大小的条带；而弱致病力菌株R1084和R10125还含有一条6.5 kb的dsRNA条带，说明同一菌株中可能含有多种dsRNA病毒。暂时未发现菌株所含dsRNA条带数目与菌株致病力之间的关系，但是致病力较弱的菌株如R10125、R1084、R0928中dsRNA条带的多样性更加丰富（图5）。自然情况下，禾谷丝核菌很少发生有性世代，一般也不产生无性孢子，其中所含病毒无法进行垂直传播，理论上只能通过菌丝融合进行水平传播，而田间复杂的自然环境又可能会影响其水平传播的效率，因此不同菌株中所含病毒种类可能会形成丰富的多样性。真菌病毒绝大多数对寄主不产生任何影响，只有少数能减弱寄主的致病力，同一病原真菌中含有多种病毒的情况也比较常见[27]。比如在核盘菌菌株Ep1PN中存在大小为6.0 kb、5.4 kb和853 bp的3种dsRNA片段：6.0 kb的条带是核盘菌RNA病毒（SsRVL），5.4 kb的条带是核盘菌致病力衰退相关的ss（ ）RNA病毒（SsDRV），853 bp的条带可能为SsDRV的缺损形式[1314，23]。其中只有5.4 kb片段病毒能够引起宿主真菌的致病力减弱[13，23]。
小麦纹枯病菌中的dsRNA具有丰富的多样性，在进一步的研究中需要对这些条带的核酸序列进行分析，明确其对寄主真菌的生物学特性尤其是致病力的影响，从而为发掘具有生防潜力的弱毒相关真菌病毒提供具有价值的参考。
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