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的体外研究针对大鼠凋亡基因Caspase-3设计的核酶(Rz107)的体外转录,切割及活性鉴定及其在大鼠肝细胞系BRL-3A细胞中的切割活性。
方法将大鼠Caspase-3基因的PCR片段克隆于T载体T7启动子下游,32P标记的体外转录物作为靶RNA。设计并合成针对于大鼠Caspase-3的核酶(Rz107),将Rz107基因克隆于自我切割核酶载体p1.5的5'-cis-核酶和3'-cis-核酶之间,同样进行32P标记转录。核酶与靶RNA按一定比例和条件保温切割,电泳后放射自显影。将携带有Rz107基因的真核表达质粒pcDNA3.1-Rz107电穿孔至BRL-3A细胞中,通过RT-PCR方法分析Rz107的细胞内剪切活性。
结果 Rz107在37℃有活性。在一定温度范围内,其切割效率随温度升高而升高,最适温度为50℃。其Km为14.13nmol/L, kcat为2.31min-1。在BRL-3A细胞中,Rz107同样具有切割活性,其切割效率为37%。
结论针对caspase-3 mRNA 设计的核酶-Rz107,体外制备具有良好的特异催化切割活性,在体外及BRL-3A细胞内均能有效剪切底物RNA。这不仅对研究凋亡的发生及其机制提供了有利的研究工具,而且可通过抑制凋亡而成为治疗一些肝脏疾病的新方法。