【目的】红松已开发的分子标记缺乏共显性的遗传标记,尚不能满足分子标记辅助育种的需要。利用转录组数据开发SSR标记目前仍然是较为经济高效的DNA分子标记开发策略,本研究利用高通量测序技术开发红松EST-SSR标记,掌握其在转录组序列中的分布类型及特征,为红松的SSR多样性分析及变异分析提供基础。【方法】利用SSR检索程序从红松转录组41 476条Unigenes中筛选得到1 757个SSR位点,并对SSR位点的数量、分布特征进行统计分析。设计合成101对SSR引物,采用琼脂糖电泳初步检查和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测方法确定引物的多态性,并收集扩增产物,送测序验证,最终开发出16对SSR引物。合成6对荧光引物,采用荧光标记技术对来自黑龙江省鹤岗、林口、铁力、苇河4个种子园的53份自由授粉子代进行遗传多样性分析。【结果】基于转录组序列开发出的EST-SSR的分布频率(SSR的个数与总Unigene的数量比)为4.24%。单、二、三核苷酸重复单元分别占总SSR的46.90%,17.12%和34.66%;SSR重复单元的重复次数分布在5~24次之间。参试的101对引物中有21对引物扩增可检测出多态性位点,占引物总数的20.8%;重测序验证,有16对引物能够扩增出目标序列。6对荧光引物共检测出18个等位基因,多态性信息量(PIC)为0.036 3~0.667 4,平均为0.325。【结论】红松属于基因组序列比较庞大的裸子植物,本研究可扩增出多态性位点的引物重复单元以二、三核苷酸重复为主。所研究红松种子园子代属于中等多态性水平。本研究印证了利用红松转录组数据开发SSR标记的可行性,同时采用荧光标记技术检测红松自由授粉子代材料,为红松种质资源的多样性水平分析及变异水平的研究提供基础。