【摘 要】
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目的:研究急性缺血缺氧大鼠线粒体ATPase6基因表达的变化,探讨急性缺血缺氧引起肠上皮细胞线粒体损害的分子机制.方法:(1)动物模型:通过失血性休克大鼠造成急性缺血缺氧模型.
【机 构】
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第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆 400042;
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目的:研究急性缺血缺氧大鼠线粒体ATPase6基因表达的变化,探讨急性缺血缺氧引起肠上皮细胞线粒体损害的分子机制.方法:(1)动物模型:通过失血性休克大鼠造成急性缺血缺氧模型.Wistar大鼠随机分成正常对照组与失血性休克组.按Wigger法放血至平均动脉压5.33 kPa,维持低血压2 h,造成急性缺血缺氧,分别于失血性休克后2 h、3 h、5 h 活杀动物.(2) 肠线粒体ATPase6基因表达测定:活杀动物后取回肠5 cm,制备肠上皮细胞悬液 ,并将细胞数调至1×109/L,用异腈酸胍盐酸盐法提取细胞总RNA.紫外测定RNA纯度和含量,并进行RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳以鉴定其完整性.RT-PCR法使用宝灵曼试剂盒.上游引物:5 -AAACGAATAACCCTTGAGAATC-3 ,下游引物:5 -TGGTGGGTCATTATGTGTTATC-3, 特异扩增715 bp大鼠线粒体ATPase6cDNA片段.(β-actin作对照).PCR反应体系为50 μL ,包括10 μL cDNA,2 μL上游引物,2 μL下游引物,5 μL 10 ×Taq酶 buffer,4 μL dNTP,3.6 μL MgCl2,22 μL DEPC水.扩增条件:95℃变性40 s,55℃退火30 s ,72℃延伸36 s,30个循环后,再在72℃下延伸9 min.扩增产物行电泳照像分析.PCR 产物为715 bp.结果:大鼠肠线粒体ATPase6mRNA在急性缺血缺氧后2 h 表达显著减少,并随休克加重而加重.讨论:能量代谢降低是线粒体损伤的重要指标.线粒体重要功能是氧化磷酸化,即底物被呼吸酶氧化,并与之相偶联的磷酸化酶系统从而释放ATP,推动细胞的各种生命活动.ATPas e6基因是编码ATP合成的F1F0-ATPase复合物的一部分,因此,研究ATPase6基因改变在能量代谢的改变中是十分重要.我们的研究发现:失血性休克晚期,ATPase6基因表达减弱,与在失血性休克缺血缺氧时F1F0-ATPase早期升高,晚期降低,质子转运下降,ATP缺乏是一致的.我们在失血性休克肠上皮细胞线粒体DNA ATPase6基因测序研究中发现缺血缺氧时存在硷基突变及编码氨基酸的改变,进而影响F1F0-ATPase蛋白的功能和ATP的合成.故失血性休克后,如何保护线粒体功能,尽早改善缺血缺氧是救治的关键.结论:失血性休克后线粒体ATPase6基因表达在肠道损害中起一定作用,其产生与休克后急性缺血缺氧有关
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