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【摘要】 目的：利用RNA干扰技术（RNAi）下调肌腱细胞中V型胶原蛋白的表达，拟为后续探讨V型胶原在损伤肌腱修复过程中的作用提供可行的试验方法。方法：分别设计干扰大鼠V型胶原[COL5（ 1）2（ 2）]两个亚基COL5 1和COL5 2表达的siRNA序列，转染大鼠肌腱细胞。通过实时荧光定量PCR和免疫荧光法检测V型胶原在基因和蛋白水平的表达。结果：转染特定的siRNA后，V型胶原两个亚基的基因表达被抑制约70%，蛋白表达也被明显抑制。结论：RNAi法可有效地抑制大鼠肌腱细胞中V型胶原的基因和蛋白水平表达。为进一步研究V型胶原在肌腱损伤修复过程中的作用提供了可行的试验方法。
【关键词】 肌腱细胞； V型胶原； RNA干扰技术； 基因表达
年龄增长和运动过度均可造成肌腱韧带损伤。目前临床上的治疗方法主要是理疗和手术缝合。由于肌腱韧带内细胞、血管较少，再生能力较差，所以愈后常由瘢痕组织修复，力学性能低下，易造成重复断裂。
V型胶原在正常肌腱组织中含量很少，但在损伤肌腱中却持续高表达52周[1]。有研究显示过多的V型胶原抑制I型胶原的自聚生长。培养抑制了V型胶原功能的纤维细胞（Ehlers-Danlos Syndrome），其所产生的Ⅰ型胶原纤维直径大于正常胶原纤维[2]。损伤肌腱修复后胶原纤维直径明显变小，而这些小直径纤维又与肌腱修复后力学性能低下相关[3-4]。所以降低V型胶原的表达可能有利于促进大直径胶原纤维的再生，提高损伤肌腱的修复效果。
RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）是近年兴起的一种高效、特异阻断靶mRNA表达而达到转录后基因沉默的新技术。能够有效地抑制目的基因的表达，产生相应功能型缺失的现象，为研究特定基因功能提供良好的工具[5-6]。
本研究设计并合成干扰V型胶原两个亚基的siRNA，转染大鼠肌腱细胞，在基因和蛋白水平检测抑制效率，筛选得到有效的干扰片段，为后续研究V型胶原的功能提供细胞水平平台和可行的试验方法。
1 材料与方法
1.1 试剂 胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、DMEM培养基（Gibco）；siRNA分子（Ambion）、LipofectamineTM2000转染试剂；mMLV逆转录试剂（Invitrogen）、real time PCR试剂盒（TaKaRa）；V型胶原一抗（millpore）、荧光二抗。
1.2 仪器 二氧化碳培养箱；生物安全柜；倒置荧光电子显微镜（Olympus）；Real-Time PCR仪（ABI 7900 HT）。
1.3 实验动物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄不限，体重250 g左右。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养 取大鼠跟腱，剥离肌腱腱膜，将组织块剪成匀浆状，用混合胶原酶消化后，加入含10%FBS的DMEM，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下（标准环境）进行原代培养。4～5 d更换1次培养基。当细胞铺满培养皿底约90%时，用胰蛋白酶消化按1：3进行传代培养。取P5以内的细胞用于后续实验。
1.4.2 siRNA序列设计 由Ambion公司设计与合成siRNA干扰序列。由于V型胶原的分子组成为COL5（ 1）2（ 2），所以分别设计了针对COL5 1和COL5 2亚基的siRNA序列，为实验序列，见表1。并提供已知有效抑制GAPDH的siRNA作为阳性对照序列（positive control， PC），FAM绿色荧光标记的乱序siRNA为阴性对照序列（negative control， NC）。
1.4.3 基因转染 将处于对数生长期的大鼠肌腱细胞按5×104/孔的密度接种于12孔板中，培养20 h后，更换无FBS的培养基后进行转染。具体方法参照Lipofectamine TM2000转染试剂说明书。培养6 h后更换含FBS的培养基。
1.4.4 实时荧光定量PCR法检测基因干扰效率 肌腱细胞转染特定的siRNA48 h后，收集肌腱细胞，提取RNA，采用两步法完成反转录聚合酶链反应（RT-PCR）（n=3）。采用b-actin做内参，用实时荧光定量PCR法（real time PCR）定量分析COL5 1和COL5 2基因的表达，所用引物见表2。
1.4.5 免疫荧光法检测蛋白抑制效率 由于乱序的siRNA自身标记FAM绿色荧光，不能用作阴性对照，所以用只加转染试剂而不加任何siRNA的肌腱细胞作为对照组（Control）（n=3）。肌腱细胞转染72 h后，去掉培养基，PBS润洗，固定，加入稀释好的一抗，置于湿盒中4 ℃过夜（为扣除背景荧光，以不加一抗的肌腱细胞作为免疫荧光的方法学对照）。次日，PBS润洗，加入荧光标记的二抗，室温避光1 h。再次用PBS润洗，荧光电子显微镜下观察结果。
1.5 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 siRNA转染效率检测 体外培养肌腱细胞见图1A。转染特定的siRNA后，用荧光显微镜观察阴性对照组肌腱细胞，结果见图1B。肌腱细胞内充满绿色荧光，表明FAM标记的siRNA进入肌腱细胞内，转染效率较高。
注：体外培养大鼠肌腱细胞（图1A）；转染FAM荧光标记siRNA的肌腱细胞（图1B）
2.2 靶向siRNA抑制V型胶原在mRNA水平的表达 肌腱细胞转染siRNA48 h后，用real time PCR法检测COL5 1和COL5 2在基因表达的水平，见图2。与阴性对照组（乱序siRNA）相比， 1（V）实验组（siRNA196227）有效抑制了肌腱细胞中COL5 1基因水平的表达， 2（V）实验组（siRNA s136862）有效抑制了肌腱细胞中COL5 2基因水平的表达。抑制程度约70%左右（P<0.05）。阳性对照组（抑制GAPDH的siRNA）有效抑制了GAPDH的表达（数据未展示）。设置阳性对照组目的为验证siRNA转染方法的有效性，见图2。 2.3 靶向siRNA抑制V型胶原在蛋白水平的表达 肌腱细胞转染siRNA72 h后，用免疫荧光法检测肌腱细胞中V型胶原蛋白水平的表达，见图3。 1（V）实验组（siRNA196227）有效抑制了肌腱细胞中Col5 1在蛋白水平的表达（图3A）， 2（V）实验组（siRNAs136862）有效抑制了肌腱细胞中Col5 2在蛋白水平的表达（图3E）。
注： 1（V）：实验组1（大鼠肌腱细胞转染siRNA196227）； 2（V）：实验组2（大鼠肌腱细胞转染siRNA s136862）；PC：阳性对照（大鼠肌腱细胞转染干扰GAPDH的siRNA）；NC：阴性对照（大鼠肌腱细胞转染FAM标记的乱序siRNA）（图2A，图2B）
注：V型胶原亚基Col5 1在蛋白水平的检测（图3A～3C）；V型胶原亚基Col5 2在蛋白水平的检测（图3D～3F）； 1（V）：实验组1（大鼠肌腱细胞转染siRNA196227）； 2（V）：实验组2（大鼠肌腱细胞转染siRNA s136862）；Control：空白对照组（大鼠肌腱细胞只加转染试剂，不加任何siRNA）
3 讨论
有研究表明损伤肌腱中V型胶原表达异常升高[1]，且过多的V型胶原抑制I型胶原的自聚生长。本实验在体外培养大鼠肌腱细胞，利用RNAi法抑制肌腱细胞中V型胶原两个亚基COL5 1和COL5 2的表达。结果表明，化学合成的siRNA分子通过脂质体转染大鼠肌腱细胞后，有效抑制了COL5 1和COL5 2在基因水平的表达，V型胶原在蛋白水平的表达也明显降低。表明RNAi法可以有效抑制V型胶原在肌腱细胞中的表达。为后续研究V型胶原在肌腱损伤修复过程中的调节作用提供可行的试验方法。也为促进损伤肌腱再生，达到结构和功能的完全恢复带来潜在的基因治疗手段。
参考文献
[1] Frank C， McDonald D， Shrive N. Collagen fibril diameters in the rabbit medial collateral ligament scar： A longer term assessment [J]. Connect Tissue Res，1997，（36）：261-269.
[2] Wenstrup R J， Florer J B， Cole W G， et al. Reduced type I collagen utilization： a pathogenic mechanism in COL5A1 haplo-insufficient Ehlers-Danlos syndrome [J]. J Cell Biochem， 2004，92（1）：113-124.
[3] Goh J C， Ouyang H W， Toh S L， et al. Tissue engineering techniques in tendon and ligament replacement [J]. Med J Malaysia，2004，59（l）：47-48.
[4] Hui J， Ouyang H W， Goh J， et al. Application of mesenchymal stem cell for musculoskeletal tissue engineering [J]. Ann SG Acad Med，2005，34（2）：206-212.
[5] Fire A， Xu S， Montgomery M K， et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditiselegans [J]. Nature，1998，391（6669）：806-811.
[6] Elbashir S M， Harborth J， Lendeckel W， et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in culturedmammalian cells [J]. Nature，2001，411（6836）：494-498.
（收稿日期：2013-05-20） （本文编辑：王宇）
【关键词】 肌腱细胞； V型胶原； RNA干扰技术； 基因表达
年龄增长和运动过度均可造成肌腱韧带损伤。目前临床上的治疗方法主要是理疗和手术缝合。由于肌腱韧带内细胞、血管较少，再生能力较差，所以愈后常由瘢痕组织修复，力学性能低下，易造成重复断裂。
V型胶原在正常肌腱组织中含量很少，但在损伤肌腱中却持续高表达52周[1]。有研究显示过多的V型胶原抑制I型胶原的自聚生长。培养抑制了V型胶原功能的纤维细胞（Ehlers-Danlos Syndrome），其所产生的Ⅰ型胶原纤维直径大于正常胶原纤维[2]。损伤肌腱修复后胶原纤维直径明显变小，而这些小直径纤维又与肌腱修复后力学性能低下相关[3-4]。所以降低V型胶原的表达可能有利于促进大直径胶原纤维的再生，提高损伤肌腱的修复效果。
RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）是近年兴起的一种高效、特异阻断靶mRNA表达而达到转录后基因沉默的新技术。能够有效地抑制目的基因的表达，产生相应功能型缺失的现象，为研究特定基因功能提供良好的工具[5-6]。
本研究设计并合成干扰V型胶原两个亚基的siRNA，转染大鼠肌腱细胞，在基因和蛋白水平检测抑制效率，筛选得到有效的干扰片段，为后续研究V型胶原的功能提供细胞水平平台和可行的试验方法。
1 材料与方法
1.1 试剂 胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、DMEM培养基（Gibco）；siRNA分子（Ambion）、LipofectamineTM2000转染试剂；mMLV逆转录试剂（Invitrogen）、real time PCR试剂盒（TaKaRa）；V型胶原一抗（millpore）、荧光二抗。
1.2 仪器 二氧化碳培养箱；生物安全柜；倒置荧光电子显微镜（Olympus）；Real-Time PCR仪（ABI 7900 HT）。
1.3 实验动物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄不限，体重250 g左右。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养 取大鼠跟腱，剥离肌腱腱膜，将组织块剪成匀浆状，用混合胶原酶消化后，加入含10%FBS的DMEM，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下（标准环境）进行原代培养。4～5 d更换1次培养基。当细胞铺满培养皿底约90%时，用胰蛋白酶消化按1：3进行传代培养。取P5以内的细胞用于后续实验。
1.4.2 siRNA序列设计 由Ambion公司设计与合成siRNA干扰序列。由于V型胶原的分子组成为COL5（ 1）2（ 2），所以分别设计了针对COL5 1和COL5 2亚基的siRNA序列，为实验序列，见表1。并提供已知有效抑制GAPDH的siRNA作为阳性对照序列（positive control， PC），FAM绿色荧光标记的乱序siRNA为阴性对照序列（negative control， NC）。
1.4.3 基因转染 将处于对数生长期的大鼠肌腱细胞按5×104/孔的密度接种于12孔板中，培养20 h后，更换无FBS的培养基后进行转染。具体方法参照Lipofectamine TM2000转染试剂说明书。培养6 h后更换含FBS的培养基。
1.4.4 实时荧光定量PCR法检测基因干扰效率 肌腱细胞转染特定的siRNA48 h后，收集肌腱细胞，提取RNA，采用两步法完成反转录聚合酶链反应（RT-PCR）（n=3）。采用b-actin做内参，用实时荧光定量PCR法（real time PCR）定量分析COL5 1和COL5 2基因的表达，所用引物见表2。
1.4.5 免疫荧光法检测蛋白抑制效率 由于乱序的siRNA自身标记FAM绿色荧光，不能用作阴性对照，所以用只加转染试剂而不加任何siRNA的肌腱细胞作为对照组（Control）（n=3）。肌腱细胞转染72 h后，去掉培养基，PBS润洗，固定，加入稀释好的一抗，置于湿盒中4 ℃过夜（为扣除背景荧光，以不加一抗的肌腱细胞作为免疫荧光的方法学对照）。次日，PBS润洗，加入荧光标记的二抗，室温避光1 h。再次用PBS润洗，荧光电子显微镜下观察结果。
1.5 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 siRNA转染效率检测 体外培养肌腱细胞见图1A。转染特定的siRNA后，用荧光显微镜观察阴性对照组肌腱细胞，结果见图1B。肌腱细胞内充满绿色荧光，表明FAM标记的siRNA进入肌腱细胞内，转染效率较高。
注：体外培养大鼠肌腱细胞（图1A）；转染FAM荧光标记siRNA的肌腱细胞（图1B）
2.2 靶向siRNA抑制V型胶原在mRNA水平的表达 肌腱细胞转染siRNA48 h后，用real time PCR法检测COL5 1和COL5 2在基因表达的水平，见图2。与阴性对照组（乱序siRNA）相比， 1（V）实验组（siRNA196227）有效抑制了肌腱细胞中COL5 1基因水平的表达， 2（V）实验组（siRNA s136862）有效抑制了肌腱细胞中COL5 2基因水平的表达。抑制程度约70%左右（P<0.05）。阳性对照组（抑制GAPDH的siRNA）有效抑制了GAPDH的表达（数据未展示）。设置阳性对照组目的为验证siRNA转染方法的有效性，见图2。 2.3 靶向siRNA抑制V型胶原在蛋白水平的表达 肌腱细胞转染siRNA72 h后，用免疫荧光法检测肌腱细胞中V型胶原蛋白水平的表达，见图3。 1（V）实验组（siRNA196227）有效抑制了肌腱细胞中Col5 1在蛋白水平的表达（图3A）， 2（V）实验组（siRNAs136862）有效抑制了肌腱细胞中Col5 2在蛋白水平的表达（图3E）。
注： 1（V）：实验组1（大鼠肌腱细胞转染siRNA196227）； 2（V）：实验组2（大鼠肌腱细胞转染siRNA s136862）；PC：阳性对照（大鼠肌腱细胞转染干扰GAPDH的siRNA）；NC：阴性对照（大鼠肌腱细胞转染FAM标记的乱序siRNA）（图2A，图2B）
注：V型胶原亚基Col5 1在蛋白水平的检测（图3A～3C）；V型胶原亚基Col5 2在蛋白水平的检测（图3D～3F）； 1（V）：实验组1（大鼠肌腱细胞转染siRNA196227）； 2（V）：实验组2（大鼠肌腱细胞转染siRNA s136862）；Control：空白对照组（大鼠肌腱细胞只加转染试剂，不加任何siRNA）
3 讨论
有研究表明损伤肌腱中V型胶原表达异常升高[1]，且过多的V型胶原抑制I型胶原的自聚生长。本实验在体外培养大鼠肌腱细胞，利用RNAi法抑制肌腱细胞中V型胶原两个亚基COL5 1和COL5 2的表达。结果表明，化学合成的siRNA分子通过脂质体转染大鼠肌腱细胞后，有效抑制了COL5 1和COL5 2在基因水平的表达，V型胶原在蛋白水平的表达也明显降低。表明RNAi法可以有效抑制V型胶原在肌腱细胞中的表达。为后续研究V型胶原在肌腱损伤修复过程中的调节作用提供可行的试验方法。也为促进损伤肌腱再生，达到结构和功能的完全恢复带来潜在的基因治疗手段。
参考文献
[1] Frank C， McDonald D， Shrive N. Collagen fibril diameters in the rabbit medial collateral ligament scar： A longer term assessment [J]. Connect Tissue Res，1997，（36）：261-269.
[2] Wenstrup R J， Florer J B， Cole W G， et al. Reduced type I collagen utilization： a pathogenic mechanism in COL5A1 haplo-insufficient Ehlers-Danlos syndrome [J]. J Cell Biochem， 2004，92（1）：113-124.
[3] Goh J C， Ouyang H W， Toh S L， et al. Tissue engineering techniques in tendon and ligament replacement [J]. Med J Malaysia，2004，59（l）：47-48.
[4] Hui J， Ouyang H W， Goh J， et al. Application of mesenchymal stem cell for musculoskeletal tissue engineering [J]. Ann SG Acad Med，2005，34（2）：206-212.
[5] Fire A， Xu S， Montgomery M K， et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditiselegans [J]. Nature，1998，391（6669）：806-811.
[6] Elbashir S M， Harborth J， Lendeckel W， et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in culturedmammalian cells [J]. Nature，2001，411（6836）：494-498.
（收稿日期：2013-05-20） （本文编辑：王宇）