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【摘 要】 目的 研究良性肿瘤垂体腺瘤中p16抑癌基因的改变和可能的作用机制。方法 用免疫组化和原位杂交技术研究p16在垂体腺瘤中的表达及其与临床病理的关系；并结合反映细胞增殖活性的指标PCNA的改变，以进一步了解p16在垂体腺瘤发生、发展过程中可能作用的分子机理。 结果 p16基因在垂体腺瘤中不发生缺失，而是存在不同程度的表达增强，其免疫组化阳性百分率的高低与肿瘤的大小、侵袭性、复发密切相关；p16的表达与PCNA呈高度正相关。 结论 p16、PCNA反映垂体腺瘤细胞的增殖活性，可能对临床预后有提示意义。
【关键词】 垂体腺瘤 p16 PCNA 免疫组化 原位杂交
【中图分类号】 R446.8 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2014）07-0333-01
抑癌基因p16定位于染色体9p21，其编码的蛋白为细胞周期蛋白依赖激酶4（CDK4）蛋白的抑制因子，参与细胞周期的调控。p16基因在多种肿瘤中的变化及其规律是抑癌基因研究的关注热点。一方面p16变化的分子机制已被揭示有基因的缺失、突变、甲基化等，另一方面以原发肿瘤临床标本为材料的大量工作证明p16改变所涉及的肿瘤种类相当广泛。
1 材料和方法
1.1 材料
11例垂体腺瘤均为上海第二医科大学附属瑞金和仁济医院新鲜垂体肿瘤切除手术标本。组织学分型为嗜酸、嗜碱、嫌色、混合性细胞腺瘤和组织增生。所有用于免疫组化和原位杂交的病理组织标本均经统一的方法进行处理，包括：4%多聚甲醛-PBS固定4～5小时后，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚6 μm，每例标本均做HE染色。
1.2 方法
1.p16和PCNA免疫组化
p16免疫组化采用Dako公司LSAB试剂盒。实验步骤包括：病理组织经前述统一方法制备后，切片经脱蜡复水，Triton-100处理，血清白蛋白封闭，抗p16多克隆抗体（C-20，Santa Cruz）1∶60稀释，4℃温育过夜。生物素化连结抗体原液室温温育20 min，辣根过氧化物酶联结的链霉亲和素1∶80稀释，室温20 min，DAB（3，3-二氨基联苯胺，辣根过氧化物酶催化底物）暗环境中显色至合适时终止反应。。操作包括：石蜡切片经脱蜡复水后，3% H2O2-甲醇处理，血清白蛋白封闭，抗PCNA单抗（IDM879，华美生物工程公司）1∶100稀释，4℃温育过夜，生物素化鼠抗1∶50稀释，室温温育45 min，过氧化物酶联结的亲和素1∶50稀释，室温温育45 min，暗环境下DAB显色合适后终止反应。
2.p16原位杂交
病理组织经前述方法统一制备，其中捞片和梯度酒精复水均用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的双蒸水。杂交前主要实验步骤为：0.1 mol/L HCl，蛋白酶K（20 μg/ml 8 min，37 ℃），1%多聚甲醛-PBS，0.1 mol/L甘氨酸和0.25%乙酸酐-0.1 mol/L三乙醇胺，然后2×SSC（标准柠檬酸钠溶液）漂洗，切片在55 ℃杂交过夜。杂交探针为p16 RNA探针（ZDP7017，0.8 kb地高辛标记。杂交后组织经浓度逐渐降低的SSC溶液漂洗，碱性磷酸酶联结的抗地高辛抗体4℃温育过夜。碱性磷酸酶催化底物NBT/BCIP暗环境中显色。
2 结果
2.1 p16免疫组化
阳性反应物位于细胞核部位，呈清晰棕色。各例中均可见到p16阳性肿瘤细胞，其中许多为体积较大、细胞核圆且大、核浆比例也较大的细胞，有些阳性染色很强呈深棕色，有些稍弱呈棕黄色。在不同的病例中，阳性细胞百分率差异较大，约在5%～95%之间。组织中绝大多数间质细胞呈阴性，经苏木素复染后细胞核为蓝色，其余呈弱阳性，即细胞核呈淡棕色。见图1（略）尸检正常垂体切片中，所有垂体前叶内分泌细胞和间质细胞都呈p16组化阴性。表明p16蛋白在肿瘤细胞中含量常常比正常细胞高。
2.2 p16与PCNA相关性的分析
用统计学上等极相关分析方法，对每例标本的p16阳性细胞百分率和相应的PCNA阳性细胞百分率，进行相关性分析，得校正Spearman等级相关系数rs’=0.852，P<0.01，表明p16与PCNA的表达呈高度正相关，见图2。（略）
2.3 p16原位杂交
11例石蜡包埋的切片中所有肿瘤细胞和间质细胞的胞浆部位均出现蓝色杂交信号，见图3（略）。阴性对照片所有细胞均不着色。表明，垂体腺瘤细胞和间质细胞均有p16基因mRNA存在。
3 讨论
在本实验p16免疫组化结果中，垂体腺瘤细胞一部分呈反应阳性，一部分阴性，而同一标本中的非肿瘤细胞的间质细胞则绝大多数为阴性，仅有少部分为阳性，且很弱。这一现象表明，组化阳性的肿瘤细胞其p16含量要比非肿瘤细胞的高。据此，本文把组化阳性的肿瘤细胞定为存在p16蛋白的过度表达。而各个病例p16阳性细胞百分率的高低，正是反映了该例肿瘤细胞p16基因过表达的程度。本实验原位杂交的结果显示间质细胞和肿瘤细胞中均存在p16的mRNA，表明p16基因在垂体腺瘤中没有缺失，那些组化阴性的细胞所含的p16蛋白含量较低。
p16的过表达可能与细胞的增殖活性有关，主要鉴于：（1）免疫组化阳性细胞多为那些体积较大、细胞核较大、核浆比例较大的肿瘤细胞，反映了这些细胞可能具有较强的增殖活性，而绝大多数间质细胞和部分肿瘤细胞呈阴性反应；（2）p16与PCNA的表达呈高度正相关，PCNA是一个分子量为36 kD的核磷蛋白，为δ-DNA聚合酶的一个辅助蛋白，是DNA复制及细胞增殖所必需的，其表达水平是反映细胞增殖活性的较好指标；（3）p16组化阳性百分率与肿瘤大小、侵袭力、复发密切相关，相应不同组之间存在着明显的差异（P<0.05）。但最近的研究表明，在部分良性和恶性肿瘤中均观察到p16蛋白表达增高的现象，且结合临床病理资料分析可见p16免疫组化阳性的病例临床表现较差，其高表达可能与不良预后有关。对于p16这一抑癌基因在恶变细胞中反而表达增多这一似乎矛盾的现象，Tam等在对一系列恶性肿瘤细胞株的研究中发现，部分肿瘤的细胞株发生了缺失，部分肿瘤的细胞株中p16表达水平较之相应的正常细胞要明显增高。这一现象提示p16基因的缺失或是过表达与肿瘤细胞的类型有关，即在不同的肿瘤中p16的改变可能有所不同，即使在同种肿瘤的不同亚型，p16的改变也可能有所不同。
参考文献
[1]王静 垂体腺瘤P16基因免疫组化检测的意义 现代临床医学 2012，1（8）：90
[2]刘丽 垂体腺瘤原位杂交检测的意义 中国免疫学杂志 2013，8（4）：34
【关键词】 垂体腺瘤 p16 PCNA 免疫组化 原位杂交
【中图分类号】 R446.8 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2014）07-0333-01
抑癌基因p16定位于染色体9p21，其编码的蛋白为细胞周期蛋白依赖激酶4（CDK4）蛋白的抑制因子，参与细胞周期的调控。p16基因在多种肿瘤中的变化及其规律是抑癌基因研究的关注热点。一方面p16变化的分子机制已被揭示有基因的缺失、突变、甲基化等，另一方面以原发肿瘤临床标本为材料的大量工作证明p16改变所涉及的肿瘤种类相当广泛。
1 材料和方法
1.1 材料
11例垂体腺瘤均为上海第二医科大学附属瑞金和仁济医院新鲜垂体肿瘤切除手术标本。组织学分型为嗜酸、嗜碱、嫌色、混合性细胞腺瘤和组织增生。所有用于免疫组化和原位杂交的病理组织标本均经统一的方法进行处理，包括：4%多聚甲醛-PBS固定4～5小时后，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚6 μm，每例标本均做HE染色。
1.2 方法
1.p16和PCNA免疫组化
p16免疫组化采用Dako公司LSAB试剂盒。实验步骤包括：病理组织经前述统一方法制备后，切片经脱蜡复水，Triton-100处理，血清白蛋白封闭，抗p16多克隆抗体（C-20，Santa Cruz）1∶60稀释，4℃温育过夜。生物素化连结抗体原液室温温育20 min，辣根过氧化物酶联结的链霉亲和素1∶80稀释，室温20 min，DAB（3，3-二氨基联苯胺，辣根过氧化物酶催化底物）暗环境中显色至合适时终止反应。。操作包括：石蜡切片经脱蜡复水后，3% H2O2-甲醇处理，血清白蛋白封闭，抗PCNA单抗（IDM879，华美生物工程公司）1∶100稀释，4℃温育过夜，生物素化鼠抗1∶50稀释，室温温育45 min，过氧化物酶联结的亲和素1∶50稀释，室温温育45 min，暗环境下DAB显色合适后终止反应。
2.p16原位杂交
病理组织经前述方法统一制备，其中捞片和梯度酒精复水均用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的双蒸水。杂交前主要实验步骤为：0.1 mol/L HCl，蛋白酶K（20 μg/ml 8 min，37 ℃），1%多聚甲醛-PBS，0.1 mol/L甘氨酸和0.25%乙酸酐-0.1 mol/L三乙醇胺，然后2×SSC（标准柠檬酸钠溶液）漂洗，切片在55 ℃杂交过夜。杂交探针为p16 RNA探针（ZDP7017，0.8 kb地高辛标记。杂交后组织经浓度逐渐降低的SSC溶液漂洗，碱性磷酸酶联结的抗地高辛抗体4℃温育过夜。碱性磷酸酶催化底物NBT/BCIP暗环境中显色。
2 结果
2.1 p16免疫组化
阳性反应物位于细胞核部位，呈清晰棕色。各例中均可见到p16阳性肿瘤细胞，其中许多为体积较大、细胞核圆且大、核浆比例也较大的细胞，有些阳性染色很强呈深棕色，有些稍弱呈棕黄色。在不同的病例中，阳性细胞百分率差异较大，约在5%～95%之间。组织中绝大多数间质细胞呈阴性，经苏木素复染后细胞核为蓝色，其余呈弱阳性，即细胞核呈淡棕色。见图1（略）尸检正常垂体切片中，所有垂体前叶内分泌细胞和间质细胞都呈p16组化阴性。表明p16蛋白在肿瘤细胞中含量常常比正常细胞高。
2.2 p16与PCNA相关性的分析
用统计学上等极相关分析方法，对每例标本的p16阳性细胞百分率和相应的PCNA阳性细胞百分率，进行相关性分析，得校正Spearman等级相关系数rs’=0.852，P<0.01，表明p16与PCNA的表达呈高度正相关，见图2。（略）
2.3 p16原位杂交
11例石蜡包埋的切片中所有肿瘤细胞和间质细胞的胞浆部位均出现蓝色杂交信号，见图3（略）。阴性对照片所有细胞均不着色。表明，垂体腺瘤细胞和间质细胞均有p16基因mRNA存在。
3 讨论
在本实验p16免疫组化结果中，垂体腺瘤细胞一部分呈反应阳性，一部分阴性，而同一标本中的非肿瘤细胞的间质细胞则绝大多数为阴性，仅有少部分为阳性，且很弱。这一现象表明，组化阳性的肿瘤细胞其p16含量要比非肿瘤细胞的高。据此，本文把组化阳性的肿瘤细胞定为存在p16蛋白的过度表达。而各个病例p16阳性细胞百分率的高低，正是反映了该例肿瘤细胞p16基因过表达的程度。本实验原位杂交的结果显示间质细胞和肿瘤细胞中均存在p16的mRNA，表明p16基因在垂体腺瘤中没有缺失，那些组化阴性的细胞所含的p16蛋白含量较低。
p16的过表达可能与细胞的增殖活性有关，主要鉴于：（1）免疫组化阳性细胞多为那些体积较大、细胞核较大、核浆比例较大的肿瘤细胞，反映了这些细胞可能具有较强的增殖活性，而绝大多数间质细胞和部分肿瘤细胞呈阴性反应；（2）p16与PCNA的表达呈高度正相关，PCNA是一个分子量为36 kD的核磷蛋白，为δ-DNA聚合酶的一个辅助蛋白，是DNA复制及细胞增殖所必需的，其表达水平是反映细胞增殖活性的较好指标；（3）p16组化阳性百分率与肿瘤大小、侵袭力、复发密切相关，相应不同组之间存在着明显的差异（P<0.05）。但最近的研究表明，在部分良性和恶性肿瘤中均观察到p16蛋白表达增高的现象，且结合临床病理资料分析可见p16免疫组化阳性的病例临床表现较差，其高表达可能与不良预后有关。对于p16这一抑癌基因在恶变细胞中反而表达增多这一似乎矛盾的现象，Tam等在对一系列恶性肿瘤细胞株的研究中发现，部分肿瘤的细胞株发生了缺失，部分肿瘤的细胞株中p16表达水平较之相应的正常细胞要明显增高。这一现象提示p16基因的缺失或是过表达与肿瘤细胞的类型有关，即在不同的肿瘤中p16的改变可能有所不同，即使在同种肿瘤的不同亚型，p16的改变也可能有所不同。
参考文献
[1]王静 垂体腺瘤P16基因免疫组化检测的意义 现代临床医学 2012，1（8）：90
[2]刘丽 垂体腺瘤原位杂交检测的意义 中国免疫学杂志 2013，8（4）：34