【摘 要】
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目的 构建重组原核表达质粒,表达类鼻疽伯克霍尔德菌Frataxin样蛋白并进行纯化. 方法 PCR扩增类鼻疽伯克霍尔德菌Frataxin基因,胶回收纯化后测序验证.用HindⅢ和Nde Ⅰ双酶切
【机 构】
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海南医学院热带医学与检验医学院,海南海口571199;海南医学院热带转化医学教育部重点实验室;海南医学院热带生物医学技术实验室;海南医学院热带医学与检验医学院,海南海口571199
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目的 构建重组原核表达质粒,表达类鼻疽伯克霍尔德菌Frataxin样蛋白并进行纯化. 方法 PCR扩增类鼻疽伯克霍尔德菌Frataxin基因,胶回收纯化后测序验证.用HindⅢ和Nde Ⅰ双酶切目的片段与pET30a(+),将目的基因片段插入含His标签序列的原核表达载体PET30a(+)中,构建重组表达质粒pET30a(+)-Frataxin,转化入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达,并进行SDS-PAGE和Western blot检测分析,通过His-HP柱及分子筛进行纯化. 结果 PCR扩增的Frataxin基因片段为327 bp,与预期大小相符.目的片段与原核表达质粒载体连接后进行PCR鉴定与测序验证,重组质粒pET30a(+)-Frataxin构建正确.重组质粒转化DE3后经IPTG诱导5h,从细菌裂解液中检测到Frataxin融合蛋白,分子质量单位约为12 ku.通过His-HP柱与分子筛纯化,获得单一SDS-PAGE条带的目的蛋白. 结论 成功表达并纯化了Frataxin样蛋白,为研究Frataxin样蛋白与铁的相互作用关系奠定了基础.
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