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【摘要】 目的 评价切开复位及使用跟骨解剖型钢板内固定治疗跟骨关节内骨折的可行性及效果。方法 对28例跟骨骨折(其中sanders分型[1]Ⅲ型20例和Ⅳ8例)均采用外侧L型切口跟骨解剖型钢板内固定术。结果 所有患者术后随访6个月~2年,26例基本恢复跟骨高度、长度、宽度;2例患者术后出现明显距下关节炎,行二期距下关节融合术。根据美国足踝外科协会跟骨骨折的评分标准:优6例、良15例、可5例、差2例,优良率达75%。结论 跟骨解剖型钢板内固定治疗sandersⅢ型和Ⅳ型跟骨关节内骨折,可以恢复跟骨的基本形态,得到较好的治疗效果。
【关键词】跟骨关节内骨折; 跟骨解剖型钢板; 骨折内固定术
Clinical analysis of Calcaneal anatomic plate fixation for intraarticular fractures of calcaneal application
YOU Chang jiang,ZHAO Yun qing,HU Xue bin.Department of General Surgery,Wudong Hospital of Wuhan,Wuhan430084,China
【Abstract】 Objective To evaluate of open reduction and the use of calcaneal anatomic plate fixation for intraarticular fractures calcaneal of the feasibility and effectiveness.Methods 28 cases of calcaneal fractures(including sanders classification of 20 cases of type Ⅲ and Ⅳ 8 cases)were L shaped incision with lateral calcaneal anatomic plate fixation.Results All patients were followed up 6 months to 2 years,26 cases regained heel height,length,width; 2 patients after apparent subtalar arthritis,line 2 subtalar arthrodesis.According to the United States Association of Foot and Ankle Surgery calcaneal fracture score criteria:excellent in 6 cases,good in 15 cases,fair in 5 cases and poor in 2 cases,good rate of 75%.Conclusion Calcaneal anatomic plate fixation for type sanders Ⅲ and type Ⅳintraarticular fractures calcaneal,can restore the basic form of heel,get a better therapeutic effect.
【Key words】Intraarticular fractures calcaneal;Calcaneal anatomic plate; Fracture fixation internal
大部分跟骨骨折是关节内骨折,主要为高能量损伤所致。随着社会交通和建筑行业的发展,车祸伤和高处坠落伤逐渐增多,跟骨骨折的发生也明显增多。随着对跟骨解剖的不断提高和CT技术突飞猛进的发展,社会越来越重视这种恢复较慢、预后较差并可以带来较高病残率的疾病[2]。我院自2005年3月至2008年12月共对28例跟骨关节内骨折患者采用切开复位跟骨解剖型钢板内固定手术,获得良好的治疗效果。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本组28例,男16例,女12例;年龄22~54岁,平均36.2岁,根据sanders分型Ⅲ型20例和Ⅳ8例;车祸伤8例,高处坠落伤14例,扭伤4例,其他2例;本组患者均为闭合性骨折,外伤至手术时间6~14 d,平均10.6 d。
手术前常规拍患足正斜位片、双跟骨的侧轴位片、患侧跟骨的半冠状位CT和三维重建。患肢抬高制动,应用冰袋冷敷和消肿药物,当跟骨外侧皮肤出现皱褶部分恢复弹性时手术。
1.2 手术方法 患者均行硬膜外麻醉,患者取侧卧位,患肢大腿上止血带,取跟骨外侧L型切口长约12 cm,全层剥离跟骨外侧软组织并加以保护,还应保护腓骨长短肌腱,跟骨结节处钢针牵引后向外翻开跟骨骨折的外侧骨壳,跟骨的后关节面塌陷,后关节面的下方明显骨质压缩,首先恢复跟骨内侧序列的解剖关系,再复位塌陷的关节面,缺损部分用自体髂骨或异体骨填充跟骨内间隙,钢针临时固定,术中拍跟骨侧位、轴位和broden位片观察跟骨形态和关节面的复位情况,最后安置跟骨解剖型钢板,至少有2或3枚螺钉固定后关节面及载距突,防止再次塌陷。
1.3 术后处理 保留伤口引流管36~48 h,应用抗生素5~7 d预防感染,术后抬高患肢,保持踝关节中立位石膏托固定2周,一般3周拆线,并加强足的主动被动内外翻的功能锻炼,6~8周扶拐下地负重活动,3个月后逐渐负重活动。
2 结果
本组28例患者术后均得到随访,术中均未发生并发症。26例一期愈合,取出内固定物,关节功能恢复良好;2例患者发生距下关节炎,症状严重影响生活质量,后行二期距下关节融合术。
3 讨论
3.1 手术治疗的必要性 跟骨在足部解剖和生物力学上发挥重要的作用,有4个关节面,跟骨后部包括距下关节面和载距突的中关节面。跟骨前部包括距下关节小的前关节面和跟骰关节鞍状关节面,跟骨的前后部分由跗骨窦和跗骨管分开,若不手术,则影响恢复跟骨高度、长度、宽度及距下关节面的解剖关系。手术治疗可以使骨折获得解剖复位,即刻稳定及术后早期功能锻炼,从而有利于距下关节面的结构和功能恢复[3]。
3.2 手术要点 手术时间应选择在伤后6~14 d[4],切口应采用跟骨外侧L型切口,全层切开皮肤和皮下组织,不应分层切开,造成软组织分离,影响血运。尽量少使用电刀,减少术后脂肪液;不要长时间钳夹皮瓣,导致皮瓣坏死[5];植骨材料最好取自体骨,否则可能出现伤口渗液,出现植入物反应。
3.3 并发症分析及处理 常见的并发症有距下关节痛、腓骨肌腱鞘炎、局部骨刺、跟骰关节炎及神经卡压症,我们通过手术中全层软组织的剥离,保护皮瓣,仔细的关节面复位,保护腓肠外侧皮神经,局部支撑植骨以及系统的功能锻炼能明显减少这些并发症的发生。
参考文献
[1] Sanders R,Fortin P,Dipasquale T,et al.Operative treatment in 120 displaced intraarticular calcaneal fractures.Results using a prognostic computed tomography scan classification.Clin Orthop Relat Res,1993,290:87 95.
[2] 陈世荣,黄朝梁,邓忠良,等.切开复位内固定治疗跟骨关节内骨折.中华创伤杂志,2004,20(5):310.
[3] 吴小峰,马金忠,陶杰,等.影响跟骨骨折术后功能评分的各因素分析.中国实用医学研究杂志,2002,1(1):17 18.
[4] 蔡斌,许伟国,凌云.跟骨重建钢板治疗关节内跟骨骨折.中国现代医学杂志,2006,16(1):151 153.
[5] 王爱国,刘建民,卢中道,等.重建钛板在跟骨关节内骨折治疗中的应用.中华创伤骨科杂志,2005,7(3):156 158.
肺腺癌细胞STAT5信号传导途径的初步研究
卫晓蕊 王启华
【摘要】 目的 探讨STAT5在肺腺癌细胞中增殖分化,抗凋亡作用与耐药之间的关系。方法 采用浓度递增法诱导A549细胞株形成耐药细胞系,免疫组检测A549及耐药株(A549/CARP)中STAT5.LRP、MRP蛋白表达情况。结果 成功诱导了A549/CARP耐药细胞株。免疫组化显示A549组、A549/CARP组STAT5阳性细胞数差异无统计学意义(P>0.05);LRP、MRP阳性细胞数差异有统计学意义(P<0.01)STAT5、LRP、MRP之间均无相关性(P>0.05)。结论 STAT5参与了肺腺癌细胞的增殖分化和抗凋亡作用,并没参与介导肺腺癌的耐药;LRP、MRP均参与了诱导肺腺癌细胞的耐药,但二者之间无相关性;LRP、MRP介导的耐药机制与STAT5信号传导途径无关;可通过破坏STAT5信号传导来控制肿瘤细胞的生长和繁殖。STAT5可能成为肺癌基因治疗的新靶点。
【关键词】肺腺癌;耐药细胞株;信号传导转录活化蛋白;多药耐药蛋白;肺耐药蛋白
Study on the signal pathway of signal transducer and activator Oftranscription 5in Iungadenocayinoma
WEI Xiao rui,WANG Qi hua.Zhengzhou yuxin hospital
【Abstract】 Objective To elucidate the relationship of signal transducer and activator of transcription 5(STAT5)in hyperplasia and differentiation,anti apoptos and drug resistance of lung Adenocarcinoma.Methods CARP resistant A549(A549/CARP)was developed by means of different dosages and the sensititvty of anticancer of anticancer drugs were screened in the A549/CARP by MTT method.Immunohi stochemican detetion of signal transducer and activator of transcription 5,lung resistance related protein(LRP)and multiple resistance protein(MRP)was carried out in A549 and A549/CARP.Results Resistant subline A549/CARP was est lished.Mmunohistemistry; there was no significant difference in the expression of STAT5 between A549/ and A549/CARP(P>0.05).There was significant difference in the expression of LRP and MRP between A549/CARP P<0.01.The expression of STAT5 is not correlated with LRP and MRP(P>0.05).There was no significant in the expression of STA5 in A549/CARP(P>0.05).The expression of STAT5 is not correlated with LRP and MRP(P>0.05).Conclusion The overexpression of LRP and MRP in drug resistance cell subline and low expression in adenocarcinoma may play a positive role in drug resistance.The drug resistan mechanism of LRPand MRP is not correlated with the pathway of STAT5.It is suggested that STAT5 play a positive role in hyperplasia,differentiation and anti apoptosis,but not in drug resistance,which will contribute to the study of treatment of lung carcinoma.
【Key words】Adenocarcinoma;Resistant cells; Signal transducer and activator of transcription 5; Lung resistance related protein; multiple resistance protein
信息传导和转录活化蛋白家族(STAT5)的研究为探索肿瘤的发病机制和防治提供了一条新的途径,已成为肿瘤分子生物学研究的特点之一。肿瘤耐药是多因素参与的过程,多药耐药是化疗是化疗失败的主要原因,因而寻找治疗肺癌的新途径,进一步探明肺癌耐药机制是十分必要的。本研究以卡铂持续诱导A549细胞株形成A549/CARP耐药株,通过免疫组化方法检测A549及A549/CARP中STAT5、多药耐药蛋白](MRP)、肺耐药蛋白(LRP)的蛋白表达情况,探讨STAT5信号传导途径在肺癌细胞的凋亡、增殖及多药耐药性方面的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 A549细胞株购自sigma公司,A549耐药株(A549/CARP)自行诱导生成。兔抗A549、MRP及LRP购自武汉博士德公司。羊抗兔IgGRP标记二抗购自北京鼎国。
1.2 方法 A549/CARP耐药细胞株的诱导:采用浓度梯度递增法诱导,细胞接种于含小剂量卡铂的培养液中,大部分细胞死亡,存活细胞缓慢生长,待细胞恢复原倍增时间,加大卡铂剂量,继续培养至终浓度为4 μg/mg卡铂的培养基中。经6个月诱导而成,命名为A549/CARP细胞株。
1.2 细胞耐药性的测定 采用MTT法,体外常规培养A549及A549/CARP细胞,MTT法测定细胞存活率,根据公式:药物组光密度值/对照组光密度值×100%,观察卡铂作用后对A549细胞株和耐药株细胞增殖的影响。
1.3 免疫组化实验 采用北京中山SP法试剂盒检测。无菌载玻片置于培养皿中,加入2×104~2×105个细胞悬液,培养12 h,细胞爬片生长,PBS洗涤;丙酮4℅固定15 min,免疫组化具体步骤参照说明书进行。
1.4 结果判断 胞核或胞浆染成棕色颗粒为样性细胞;选择5个具有代表性的高倍视野,计数100个细胞中阳性细胞个数/HPx5作为统计数据。所有照片均采用免疫组化SP法×200。
1.5 统计学处理 检测数据以x±s表示,采用SPSS11.5统计软件包处理,采用Student非配对F检验,检验水平α=0.05。
2 结果
2.1 检测细胞耐药性 存活率与光密度值呈正比,随药物剂量的增加,A549存活率较A549/CARP明显降低,A549/CARP对卡铂低度敏感,形成耐药细胞系0.29±0.19,0.59±0.14,P<0.01。
2.2 免疫组化 A549/CARP组LRP表达明显高于A549组,有显著性差异P<0.01,阳性率分别为24%和34%;A549/CARP组MRP表达明显高于A549组,有显著性差异P<0.01阳性率分别为22%和30%;A549/CARP组STAT5与A549组比较,无显著性差异(P>0.05),阳性率分别为29%和33%。A549/CARP组经相关分析STT5与LRP无相关性(r= 0.321,P>0.05),STAT5与MRP无相关性(r= 0.254,P>0.05)A549/CARP组经相关分析,MRP与LRP无相关性(r= 0.061,P>0.05)。
3 讨论
STAT5是影响细胞增殖、分化、凋亡的一类潜在的转录因子,迄今为止,在哺乳动物中发现STAT家庭包括7个成员,即STAT1 6,其中STAT5包括STAT5A和STAT5B。STAT5在唾液腺、胰腺上皮细胞等外分泌器官缺乏,而在内分泌器官STAT5却特异表达[1],被定义为一个新的癌基因[2]。STAT5具有多种功能,如参与造血调控、免疫系统调节等,其持续活化与肿瘤的发生、发展密切相关、是近年来研究热点。
本研究采用卡铂作用于A549细胞株,通过浓度梯度递增法诱导形成A549/CARP耐药细胞系,获得了自行构建的耐药株。我们采用免疫组化技术检测A549及耐药株A549/CARP中LRP、MRP的表达水平,了解二者介导细胞耐药性的产生情况和相关性的分析,证实A549/CARP细胞系中存在LRP、MRP的过度表达,且二者有显著性差异。而未经化疗药物诱导的细胞株(A549)亦有一定的阳性表达,提示LRP、MRP是产生原发性耐药的机制之一。本实验未证明LRP的表达与MRP有相关性,与文献报道有差异[3],可能与以下因素有关:①体外培养细胞传代中产生的耐药性变异;②细胞固定条件;③标本来源不同。另外,LRP和MRP的表达在体外培养与组织切片之间是否有差异国内外未见相关研究,因此对它们之间是否具有相关性,还有待进一步探讨。
STAT5通过阻止细胞凋亡来促进肿瘤形成,有潜在抗化疗作用[4]。近年研究显示,在多种人类肿瘤细胞中,STAT5表现出成组性满打激活。故有报道认为抑制STAT5的活化不仅能防止肿瘤的发展,还能增强肿瘤细胞对化疗的敏感性。本研究采用免疫组化和蛋白印迹法,在A549T与A549/CARP中均可检出STAT5 蛋白的表达,提示STAT5介导了细胞增殖、分化、凋亡受阻,但STAT5在卡铂诱导前后的持续性激活无显著差异,提示STAT5并未介导细胞的耐药。如果能将靶向性地阻断STAT5信号的物质与传统的药物结合使用,可能会使抗肿瘤治疗更为有效。活化的STAT5对肿瘤细胞的形成、生长、凋亡抑制等过程起着重要的调控作用。因此,可通过破坏STAT5信号传导来控制肿瘤细胞的生长和增殖。我们的工作初步揭示了STAT5与肿瘤多药耐药等方面的关系,为肺癌以STAT5为靶向的基因治疗提供了重要的理论与实验依据。
参考文献
[1] Nevalainen MT,Xie JW,Bubendof L,et al.Basal activation of transcription factor signal transducer and caticator of transcription(STAST5)in non pregnant mouse and human breast epitheliur.molecular Endocrinology.
[2] Ren S,Cai HR,Li M,et al.Loss of Stat5a delays mammary cancer progressionin a mouse model.Oncogene,2002,21(27):4335 4339.
[3] 王杰,刘叙议,蒋薇,等.LRP、MRP、MDRI基因在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义,中华肿瘤杂志,2000,22,(4):304 307.
[4] Cathett falcone R,Dalton WS,Jove R.STAT proteins as noveltargets for cancer therapy.Signal transducer activator of transcription.Curr opinoncol,1999,11(6):490 496.
【关键词】跟骨关节内骨折; 跟骨解剖型钢板; 骨折内固定术
Clinical analysis of Calcaneal anatomic plate fixation for intraarticular fractures of calcaneal application
YOU Chang jiang,ZHAO Yun qing,HU Xue bin.Department of General Surgery,Wudong Hospital of Wuhan,Wuhan430084,China
【Abstract】 Objective To evaluate of open reduction and the use of calcaneal anatomic plate fixation for intraarticular fractures calcaneal of the feasibility and effectiveness.Methods 28 cases of calcaneal fractures(including sanders classification of 20 cases of type Ⅲ and Ⅳ 8 cases)were L shaped incision with lateral calcaneal anatomic plate fixation.Results All patients were followed up 6 months to 2 years,26 cases regained heel height,length,width; 2 patients after apparent subtalar arthritis,line 2 subtalar arthrodesis.According to the United States Association of Foot and Ankle Surgery calcaneal fracture score criteria:excellent in 6 cases,good in 15 cases,fair in 5 cases and poor in 2 cases,good rate of 75%.Conclusion Calcaneal anatomic plate fixation for type sanders Ⅲ and type Ⅳintraarticular fractures calcaneal,can restore the basic form of heel,get a better therapeutic effect.
【Key words】Intraarticular fractures calcaneal;Calcaneal anatomic plate; Fracture fixation internal
大部分跟骨骨折是关节内骨折,主要为高能量损伤所致。随着社会交通和建筑行业的发展,车祸伤和高处坠落伤逐渐增多,跟骨骨折的发生也明显增多。随着对跟骨解剖的不断提高和CT技术突飞猛进的发展,社会越来越重视这种恢复较慢、预后较差并可以带来较高病残率的疾病[2]。我院自2005年3月至2008年12月共对28例跟骨关节内骨折患者采用切开复位跟骨解剖型钢板内固定手术,获得良好的治疗效果。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本组28例,男16例,女12例;年龄22~54岁,平均36.2岁,根据sanders分型Ⅲ型20例和Ⅳ8例;车祸伤8例,高处坠落伤14例,扭伤4例,其他2例;本组患者均为闭合性骨折,外伤至手术时间6~14 d,平均10.6 d。
手术前常规拍患足正斜位片、双跟骨的侧轴位片、患侧跟骨的半冠状位CT和三维重建。患肢抬高制动,应用冰袋冷敷和消肿药物,当跟骨外侧皮肤出现皱褶部分恢复弹性时手术。
1.2 手术方法 患者均行硬膜外麻醉,患者取侧卧位,患肢大腿上止血带,取跟骨外侧L型切口长约12 cm,全层剥离跟骨外侧软组织并加以保护,还应保护腓骨长短肌腱,跟骨结节处钢针牵引后向外翻开跟骨骨折的外侧骨壳,跟骨的后关节面塌陷,后关节面的下方明显骨质压缩,首先恢复跟骨内侧序列的解剖关系,再复位塌陷的关节面,缺损部分用自体髂骨或异体骨填充跟骨内间隙,钢针临时固定,术中拍跟骨侧位、轴位和broden位片观察跟骨形态和关节面的复位情况,最后安置跟骨解剖型钢板,至少有2或3枚螺钉固定后关节面及载距突,防止再次塌陷。
1.3 术后处理 保留伤口引流管36~48 h,应用抗生素5~7 d预防感染,术后抬高患肢,保持踝关节中立位石膏托固定2周,一般3周拆线,并加强足的主动被动内外翻的功能锻炼,6~8周扶拐下地负重活动,3个月后逐渐负重活动。
2 结果
本组28例患者术后均得到随访,术中均未发生并发症。26例一期愈合,取出内固定物,关节功能恢复良好;2例患者发生距下关节炎,症状严重影响生活质量,后行二期距下关节融合术。
3 讨论
3.1 手术治疗的必要性 跟骨在足部解剖和生物力学上发挥重要的作用,有4个关节面,跟骨后部包括距下关节面和载距突的中关节面。跟骨前部包括距下关节小的前关节面和跟骰关节鞍状关节面,跟骨的前后部分由跗骨窦和跗骨管分开,若不手术,则影响恢复跟骨高度、长度、宽度及距下关节面的解剖关系。手术治疗可以使骨折获得解剖复位,即刻稳定及术后早期功能锻炼,从而有利于距下关节面的结构和功能恢复[3]。
3.2 手术要点 手术时间应选择在伤后6~14 d[4],切口应采用跟骨外侧L型切口,全层切开皮肤和皮下组织,不应分层切开,造成软组织分离,影响血运。尽量少使用电刀,减少术后脂肪液;不要长时间钳夹皮瓣,导致皮瓣坏死[5];植骨材料最好取自体骨,否则可能出现伤口渗液,出现植入物反应。
3.3 并发症分析及处理 常见的并发症有距下关节痛、腓骨肌腱鞘炎、局部骨刺、跟骰关节炎及神经卡压症,我们通过手术中全层软组织的剥离,保护皮瓣,仔细的关节面复位,保护腓肠外侧皮神经,局部支撑植骨以及系统的功能锻炼能明显减少这些并发症的发生。
参考文献
[1] Sanders R,Fortin P,Dipasquale T,et al.Operative treatment in 120 displaced intraarticular calcaneal fractures.Results using a prognostic computed tomography scan classification.Clin Orthop Relat Res,1993,290:87 95.
[2] 陈世荣,黄朝梁,邓忠良,等.切开复位内固定治疗跟骨关节内骨折.中华创伤杂志,2004,20(5):310.
[3] 吴小峰,马金忠,陶杰,等.影响跟骨骨折术后功能评分的各因素分析.中国实用医学研究杂志,2002,1(1):17 18.
[4] 蔡斌,许伟国,凌云.跟骨重建钢板治疗关节内跟骨骨折.中国现代医学杂志,2006,16(1):151 153.
[5] 王爱国,刘建民,卢中道,等.重建钛板在跟骨关节内骨折治疗中的应用.中华创伤骨科杂志,2005,7(3):156 158.
肺腺癌细胞STAT5信号传导途径的初步研究
卫晓蕊 王启华
【摘要】 目的 探讨STAT5在肺腺癌细胞中增殖分化,抗凋亡作用与耐药之间的关系。方法 采用浓度递增法诱导A549细胞株形成耐药细胞系,免疫组检测A549及耐药株(A549/CARP)中STAT5.LRP、MRP蛋白表达情况。结果 成功诱导了A549/CARP耐药细胞株。免疫组化显示A549组、A549/CARP组STAT5阳性细胞数差异无统计学意义(P>0.05);LRP、MRP阳性细胞数差异有统计学意义(P<0.01)STAT5、LRP、MRP之间均无相关性(P>0.05)。结论 STAT5参与了肺腺癌细胞的增殖分化和抗凋亡作用,并没参与介导肺腺癌的耐药;LRP、MRP均参与了诱导肺腺癌细胞的耐药,但二者之间无相关性;LRP、MRP介导的耐药机制与STAT5信号传导途径无关;可通过破坏STAT5信号传导来控制肿瘤细胞的生长和繁殖。STAT5可能成为肺癌基因治疗的新靶点。
【关键词】肺腺癌;耐药细胞株;信号传导转录活化蛋白;多药耐药蛋白;肺耐药蛋白
Study on the signal pathway of signal transducer and activator Oftranscription 5in Iungadenocayinoma
WEI Xiao rui,WANG Qi hua.Zhengzhou yuxin hospital
【Abstract】 Objective To elucidate the relationship of signal transducer and activator of transcription 5(STAT5)in hyperplasia and differentiation,anti apoptos and drug resistance of lung Adenocarcinoma.Methods CARP resistant A549(A549/CARP)was developed by means of different dosages and the sensititvty of anticancer of anticancer drugs were screened in the A549/CARP by MTT method.Immunohi stochemican detetion of signal transducer and activator of transcription 5,lung resistance related protein(LRP)and multiple resistance protein(MRP)was carried out in A549 and A549/CARP.Results Resistant subline A549/CARP was est lished.Mmunohistemistry; there was no significant difference in the expression of STAT5 between A549/ and A549/CARP(P>0.05).There was significant difference in the expression of LRP and MRP between A549/CARP P<0.01.The expression of STAT5 is not correlated with LRP and MRP(P>0.05).There was no significant in the expression of STA5 in A549/CARP(P>0.05).The expression of STAT5 is not correlated with LRP and MRP(P>0.05).Conclusion The overexpression of LRP and MRP in drug resistance cell subline and low expression in adenocarcinoma may play a positive role in drug resistance.The drug resistan mechanism of LRPand MRP is not correlated with the pathway of STAT5.It is suggested that STAT5 play a positive role in hyperplasia,differentiation and anti apoptosis,but not in drug resistance,which will contribute to the study of treatment of lung carcinoma.
【Key words】Adenocarcinoma;Resistant cells; Signal transducer and activator of transcription 5; Lung resistance related protein; multiple resistance protein
信息传导和转录活化蛋白家族(STAT5)的研究为探索肿瘤的发病机制和防治提供了一条新的途径,已成为肿瘤分子生物学研究的特点之一。肿瘤耐药是多因素参与的过程,多药耐药是化疗是化疗失败的主要原因,因而寻找治疗肺癌的新途径,进一步探明肺癌耐药机制是十分必要的。本研究以卡铂持续诱导A549细胞株形成A549/CARP耐药株,通过免疫组化方法检测A549及A549/CARP中STAT5、多药耐药蛋白](MRP)、肺耐药蛋白(LRP)的蛋白表达情况,探讨STAT5信号传导途径在肺癌细胞的凋亡、增殖及多药耐药性方面的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 A549细胞株购自sigma公司,A549耐药株(A549/CARP)自行诱导生成。兔抗A549、MRP及LRP购自武汉博士德公司。羊抗兔IgGRP标记二抗购自北京鼎国。
1.2 方法 A549/CARP耐药细胞株的诱导:采用浓度梯度递增法诱导,细胞接种于含小剂量卡铂的培养液中,大部分细胞死亡,存活细胞缓慢生长,待细胞恢复原倍增时间,加大卡铂剂量,继续培养至终浓度为4 μg/mg卡铂的培养基中。经6个月诱导而成,命名为A549/CARP细胞株。
1.2 细胞耐药性的测定 采用MTT法,体外常规培养A549及A549/CARP细胞,MTT法测定细胞存活率,根据公式:药物组光密度值/对照组光密度值×100%,观察卡铂作用后对A549细胞株和耐药株细胞增殖的影响。
1.3 免疫组化实验 采用北京中山SP法试剂盒检测。无菌载玻片置于培养皿中,加入2×104~2×105个细胞悬液,培养12 h,细胞爬片生长,PBS洗涤;丙酮4℅固定15 min,免疫组化具体步骤参照说明书进行。
1.4 结果判断 胞核或胞浆染成棕色颗粒为样性细胞;选择5个具有代表性的高倍视野,计数100个细胞中阳性细胞个数/HPx5作为统计数据。所有照片均采用免疫组化SP法×200。
1.5 统计学处理 检测数据以x±s表示,采用SPSS11.5统计软件包处理,采用Student非配对F检验,检验水平α=0.05。
2 结果
2.1 检测细胞耐药性 存活率与光密度值呈正比,随药物剂量的增加,A549存活率较A549/CARP明显降低,A549/CARP对卡铂低度敏感,形成耐药细胞系0.29±0.19,0.59±0.14,P<0.01。
2.2 免疫组化 A549/CARP组LRP表达明显高于A549组,有显著性差异P<0.01,阳性率分别为24%和34%;A549/CARP组MRP表达明显高于A549组,有显著性差异P<0.01阳性率分别为22%和30%;A549/CARP组STAT5与A549组比较,无显著性差异(P>0.05),阳性率分别为29%和33%。A549/CARP组经相关分析STT5与LRP无相关性(r= 0.321,P>0.05),STAT5与MRP无相关性(r= 0.254,P>0.05)A549/CARP组经相关分析,MRP与LRP无相关性(r= 0.061,P>0.05)。
3 讨论
STAT5是影响细胞增殖、分化、凋亡的一类潜在的转录因子,迄今为止,在哺乳动物中发现STAT家庭包括7个成员,即STAT1 6,其中STAT5包括STAT5A和STAT5B。STAT5在唾液腺、胰腺上皮细胞等外分泌器官缺乏,而在内分泌器官STAT5却特异表达[1],被定义为一个新的癌基因[2]。STAT5具有多种功能,如参与造血调控、免疫系统调节等,其持续活化与肿瘤的发生、发展密切相关、是近年来研究热点。
本研究采用卡铂作用于A549细胞株,通过浓度梯度递增法诱导形成A549/CARP耐药细胞系,获得了自行构建的耐药株。我们采用免疫组化技术检测A549及耐药株A549/CARP中LRP、MRP的表达水平,了解二者介导细胞耐药性的产生情况和相关性的分析,证实A549/CARP细胞系中存在LRP、MRP的过度表达,且二者有显著性差异。而未经化疗药物诱导的细胞株(A549)亦有一定的阳性表达,提示LRP、MRP是产生原发性耐药的机制之一。本实验未证明LRP的表达与MRP有相关性,与文献报道有差异[3],可能与以下因素有关:①体外培养细胞传代中产生的耐药性变异;②细胞固定条件;③标本来源不同。另外,LRP和MRP的表达在体外培养与组织切片之间是否有差异国内外未见相关研究,因此对它们之间是否具有相关性,还有待进一步探讨。
STAT5通过阻止细胞凋亡来促进肿瘤形成,有潜在抗化疗作用[4]。近年研究显示,在多种人类肿瘤细胞中,STAT5表现出成组性满打激活。故有报道认为抑制STAT5的活化不仅能防止肿瘤的发展,还能增强肿瘤细胞对化疗的敏感性。本研究采用免疫组化和蛋白印迹法,在A549T与A549/CARP中均可检出STAT5 蛋白的表达,提示STAT5介导了细胞增殖、分化、凋亡受阻,但STAT5在卡铂诱导前后的持续性激活无显著差异,提示STAT5并未介导细胞的耐药。如果能将靶向性地阻断STAT5信号的物质与传统的药物结合使用,可能会使抗肿瘤治疗更为有效。活化的STAT5对肿瘤细胞的形成、生长、凋亡抑制等过程起着重要的调控作用。因此,可通过破坏STAT5信号传导来控制肿瘤细胞的生长和增殖。我们的工作初步揭示了STAT5与肿瘤多药耐药等方面的关系,为肺癌以STAT5为靶向的基因治疗提供了重要的理论与实验依据。
参考文献
[1] Nevalainen MT,Xie JW,Bubendof L,et al.Basal activation of transcription factor signal transducer and caticator of transcription(STAST5)in non pregnant mouse and human breast epitheliur.molecular Endocrinology.
[2] Ren S,Cai HR,Li M,et al.Loss of Stat5a delays mammary cancer progressionin a mouse model.Oncogene,2002,21(27):4335 4339.
[3] 王杰,刘叙议,蒋薇,等.LRP、MRP、MDRI基因在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义,中华肿瘤杂志,2000,22,(4):304 307.
[4] Cathett falcone R,Dalton WS,Jove R.STAT proteins as noveltargets for cancer therapy.Signal transducer activator of transcription.Curr opinoncol,1999,11(6):490 496.