【摘 要】
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目的探讨沉默P2X4R对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病(PD)细胞模型的作用及其机制。方法(1)将给予6-OHDA作用的SH-SY5Y细胞依据6-OHDA浓度的不同分为0 µmol/L 6-OHDA组、50 µmol/L 6-OHDA组、100 µmol/L 6-OHDA组和150 µmol/L 6-OHDA组，采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组细胞的存活率，Wester
【机 构】
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内蒙古医科大学研究生院，呼和浩特 010058,内蒙古医科大学研究生院，呼和浩特 010058,内蒙古医科大学附属医院神经内科，呼和浩特 010059,内蒙古医科大学附属医院神经内科，呼和浩特 010
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目的探讨沉默P2X4R对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病(PD)细胞模型的作用及其机制。
方法(1)将给予6-OHDA作用的SH-SY5Y细胞依据6-OHDA浓度的不同分为0 µmol/L 6-OHDA组、50 µmol/L 6-OHDA组、100 µmol/L 6-OHDA组和150 µmol/L 6-OHDA组，采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组细胞的存活率，Western blotting及实时定量RT-PCR法检测P2X4R蛋白和mRNA的表达，以筛选出最适宜诱导PD细胞模型的6-OHDA浓度。(2)用不同序列的P2X4R-小干扰RNA(siRNA)慢病毒质粒(P2X4R-siRNA540、P2X4R-siRNA792、P2X4R-siRNA1401)及无义序列对照质粒(NC-siRNA)分别转染对数生长期的SH-SY5Y细胞(P2X4R-siRNA540组、P2X4R-siRNA792组、P2X4R-siRNA1401组和NC-siRNA组)，采用Western blotting及实时定量RT-PCR法检测P2X4R蛋白和mRNA的表达，以筛选出沉默效果最好的P2X4R-siRNA序列构建P2X4R沉默细胞系。(3)将沉默效果最好的P2X4R-siRNA慢病毒质粒、NC-siRNA及P2X4R拮抗剂CORM-2分别转染最适宜浓度的6-OHDA诱导的PD细胞(PD+NC-siRNA组、PD+P2X4R-siRNA组和PD+CORM-2组)，采用CCK-8法及流式细胞法检测各组细胞的存活率及凋亡率，Western blotting实验检测缝隙连接蛋白-1(PANX1)、Toll样受体-2(TLR-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和活化Caspase-3蛋白的表达。(4)合成PANX1及TLR-2过表达质粒(pCMV3-PANX1、pCMV3-TLR2)，并与阴性对照质粒(pCMV3-NCV)分别转染PD+P2X4R-siRNA组细胞(PD+P2X4R-siRNA+pCMV3-TLR2组、PD+P2X4R-siRNA+pCMV3-PANX1组和PD+P2X4R-siRNA+pCMV3-NCV组)，采用CCK-8法及流式细胞法检测各组细胞的存活率及凋亡率，Western blotting实验检测TLR-2、Caspase-3和活化Caspase-3蛋白的表达。
结果(1)与0 µmol/L 6-OHDA组相比，50、100、150 µmol/L 6-OHDA组的细胞存活率呈剂量依赖性明显降低，P2X4R蛋白和mRNA表达呈剂量依赖性明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中100 µmol/L 6-OHDA最适宜诱导PD细胞模型。(2)与NC-siRNA组相比，P2X4R-siRNA540组、P2X4R-siRNA792组和P2X4R-siRNA1401组的P2X4R mRNA和蛋白表达均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中P2X4R-siRNA540组的P2X4R mRNA和蛋白表达最低。(3)与PD+NC-siRNA组相比，PD+P2X4R-siRNA组和PD+CORM-2组的细胞存活率均明显升高，细胞凋亡率均明显下降，Caspase-3、活化Caspase-3、PANX1和TLR-2蛋白的表达均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)与PD+P2X4R-siRNA+pCMV3-NCV相比，PD+P2X4R-siRNA+pCMV3-PANX1组TLR2蛋白的表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；PD+P2X4R-siRNA+pCMV3-TLR2组的细胞存活率明显提高，细胞凋亡率明显下降，Caspase-3和活化Caspase-3蛋白的表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。
结论沉默P2X4R可以明显提高6-OHDA诱导的PD细胞模型的存活率，减少凋亡率，降低凋亡相关蛋白(Caspase-3和活化Caspase-3)的表达，发挥出神经保护作用，其机制可能与PANX1/TLR-2信号通路有关。
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