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摘要 通过比较分析不同溶剂提取液中柳兰化学成分的差异，筛选出柳兰入药的最佳提取溶剂。分别用蒸馏水、70%乙醇、100%乙醇、乙腈、乙酸乙酯、正丁醇和石油醚7种提取溶剂对柳兰全草粉末进行浸提，用液质联用QTof对提取液的化学成分进行鉴定和分析。结果表明，7种不同溶剂的柳兰提取液中化学成分共有57种，主要为脂肪酸、酚酸類、黄酮类及醇类4大类化合物，含量最高均为脂肪酸，有且只有一种共有化学成分棕榈酸。不同溶剂的提取液中化学成分的数量、种类及含量均明显不同，可见提取溶剂对植物提取物化学成分的影响较大。从柳兰已知的主要药理作用来看，正丁醇和石油醚适用于抗氧化作用提取溶剂，水和70%乙醇适用于抗炎抑菌作用提取剂，乙酸乙酯适用于镇痛和抗癌作用提取剂。综合药理作用、毒副作用及生产工艺成本，70%乙醇可成为柳兰提取的常用溶剂。
关键词 柳兰;提取溶剂;化成成分;差异比较
中图分类号 R 284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）19-0151-06
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.19.040
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Effects of Different Extraction Solvents on the Chemical Composition of Epilobium angustifolium L.
HAN Yang-yang1，2，LIAO Cheng-song1，2
（1.Xilingol Bioengineering Research Institute， Xilinghot，Inner Mongolia 026000;2.Xilingol Vocational College， Xilinghot，Inner Mongolia 026000）
Abstract By comparing and analyzing the differences of chemical components in different solvent extracts， the best extraction solvent was selected. 7 extraction solvents （distilled water， 70% ethanol， 100% ethanol， acetonitrile， ethyl acetate， n-butanol and petroleum ether） were used to extract the whole grass powder of Epilobium angustifolium ， and the chemical components of the extract were identified and analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry QTOF. The results showed that there were 57 kinds of chemical components in the 7 different solvents， mainly including fatty acids， phenolic acids， flavonoids and alcohols. The highest content was fatty acids， and there was only one common chemical component palmitic acid. The quantity， species and content of the chemical components in the extracts of different solvents were obviously different. It could be seen that the extraction solvent had a great influence on the chemical components of plant extracts. According to the known main pharmacological effects of Epilobium angustifolium ， n-butanol and petroleum ether were suitable for antioxidant extraction solvent， water and 70% ethanol were suitable for anti-inflammatory and bacteriostatic extracts， and ethyl acetate was suitable for analgesic and anticancer extracts. Considering the pharmacological effects， side effects and production process cost， 70% ethanol could be a common solvent for Epilobium angustifolium extraction.
Key words Epilobium angustifolium L.;Extraction solvent;Chemical composition;Difference comparison
基金项目 锡林郭勒职业学院课题（ZD-2020-03）;内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY19339）。 作者简介 韩阳阳（1989—），女，河北丰宁人，工程师，硕士，从事天然产物分析及代谢机理研究。*通信作者，副教授，博士，从事野生药用植物驯化栽培和民族药方剂与成分分析研究。
收稿日期 2021-03-22
柳兰（ Epilobium angustifolium L.）是多年粗壮草本，直立，丛生，又名红筷子、遍山红[1]。柳兰属于喜光植物，一般野生于草地、林缘、高山草甸、河滩、砾石坡等地，性耐寒，耐贫瘠，广泛分布于北温带与寒带地区，在我国柳兰多分布于四川、西藏、云南等地。柳兰作为传统中草药，味苦，性平，有小毒，多见于青藏地区[2]。据《青藏高原甘南藏药植物志》等记载，柳兰具有镇痛、活血作用，且可治疗肠胃疾病[3]。柳兰在现代研究中，具有抗炎、抗菌、抗焦虑、抗氧化、抑制前列腺细胞增殖、免疫调节等药理作用[4]。随着科学水平的不断发展，从药用原材料中提取主要成分的技术不断精进，而这其中溶剂的选择至关重要，因为不同提取溶剂对不同成分的浸出往往起决定性作用[5，10-12]。笔者分别用蒸馏水、70%乙醇、100%乙醇、乙腈、乙酸乙酯、正丁醇和石油醚7种不同溶剂对柳兰全草粉末进行浸提，用液质联用QTof对提取液的化学成分进行鉴定和分析，比较不同溶剂提取液中柳兰化学成分的差异，筛选出柳兰入药的最佳提取溶剂，为后续柳兰成药开发提供方法指导。
1 材料与方法
1.1 仪器
G2-XS QTof液质联用仪（Waters，美国）;FW100研磨机（天津泰斯特仪器有限公司）;BY-30AD超声萃取仪（上海秉越电子仪器有限公司）;AXTG16G离心机（盐城市安信实验仪器有限公司）;HSC-24B氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）。
1.2 试材
柳兰全草（从内蒙古锡林浩特市柳兰沟采集，经内蒙古大学胡日查教授鉴定）;乙醇（HPLC，北京迈瑞达科技有限公司）;乙腈（HPLC，北京迈瑞达科技有限公司）;正丁醇（HPLC，天津市康科德科技有限公司）;乙酸乙酯（HPLC，北京迈瑞达科技有限公司）;石油醚（AR，国药集团化学试剂有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 柳兰化学成分的提取。取柳兰全草晾干，研磨成粉，4 ℃冰箱备用。取柳兰粉0.1 g于1.5 mL离心管内，分别加入提取溶剂蒸馏水、70%乙醇、100%乙醇、乙腈、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚1 mL，30 ℃超声提取30 min后，于12 000 r/min离心10 min，取上层清液氮吹干后，用乙腈复溶上机。
1.3.2 QTof液质联用条件。色谱柱为Waters ACQUIY UPLC BEH Shield RP18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相A为水（含0.1%甲酸），B为乙腈（含0.1%甲酸），梯度：0 → 8.0 min，80% B;8.0→ 10.0 min，80% → 100% B;10.0→ 12.0 min，100% B;12.0→ 12.1 min，100% → 20% B;12.1→14.0 min，20% B;14.0→17.0 min，100% B;17.0→18.2 min，100%→80% B;18.2 → 25.0 min，80% B;流速0.4 mL/min，柱温 40 ℃，Tof采集为正离子模式，质量检测范围为100～1 200 Da;毛细管电压为3 kV;样品锥电压为40 V;萃取锥电压为4 V;离子源温度为100 ℃;去溶剂温度为400 ℃;去溶剂化气体为800 L/h，锁定质量为556.276 6（正离子模式）。准确度误差阈值固定在5 mDa。数据采集由MassLynx 4.1软件控制。
2 结果与分析
2.1 柳兰不同溶剂提取液中化学成分分析
根据“1.3.1”方法，蒸馏水、70%乙醇、100%乙醇、乙腈、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚提取柳兰的总离子流图如图1所示。经Tof自建库分析，以上几种溶剂提取柳兰化学成分如表1所示。
天然草药化学成分复杂，柳兰经不同溶剂提取后，提取液经Tof法分析，由表1可知，共得到57种化合物。其中蒸馏水提取化学成分20种，山奈酚-8-O-甲基醚含量最高，为29.82%，其次是辛酸、亚油酸等脂肪酸类化合物以及酚酸类化合物，其中3-O-阿魏酰奎宁酸等含量较高。70%乙醇检测出化学成分24种，含量最高的是硬脂酸（57.89%），其次分别是肉豆蔻酸（16.51%）和山奈酚（12.63%）。100%乙醇提取柳兰化学成分26种，含量以脂肪酸中肉豆蔻酸（45.66%）为最高，而亚麻酸含量也高达16.81%。乙腈提取柳兰化合物检测出27种成分，山奈酚-8-O-甲基醚含量最高，为19.25%，其次为花生酸和豆甾醇，含量分别为14.83%和12.51%。7种溶剂中乙酸乙酯提取液中柳兰化学成分最多，为33种，含量最高为萜类化合物齐墩果酸26.43%，而脂肪酸中除肉豆蔻酸外，还分析得到花生酸、二十四酸等物质。正丁醇提取物中含化合物19种，以硬脂酸含量最高，为61.48%，其酯类化合物己酸-β-谷甾醇酯含量为5.08%。石油醚是混合物，提取出柳兰成分18种，其中含量最高的为硬脂酸（60.65%），脂肪酸中油酸的含量占11.34%。不同溶剂提取液中柳兰的化学成分差异较大，7种溶剂提取出的相同化学成分仅有棕榈酸一种，按上述顺序含量分别为1.82%、0.24%、9.06%、7.91%、3.95%、1.75%、7.29%。
2.2 柳兰不同溶剂提取液中化学成分功能分类与差异比较
将不同溶剂提取物中鉴定到的柳兰化学成分按功能进行分类，结果如表2所示。由表2可知，提取液中所含化学物质主要是脂肪酸、酚酸类、黄酮类及甾醇类4大类化合物，另外有少量的酯类化合物，萜类化合物只有一种齐墩果酸，而醚类化合物只有山奈酚-8-O-甲基醚。结合表2和表3，蒸馏水提取物中酚酸类化合物最多，有9种，没有提取出黄酮类化合物，可能由于蒸馏水为无机溶剂，与黄酮类化合物相容性较低所影响。70%乙醇是有机-无机两相混合提取溶剂，其柳兰提取物中有7种脂肪酸和7种酚酸类化合物，与其他溶剂提取物相比，黄酮类和甾醇类化合物较多，种类比较齐全。100%乙醇提取物中脂肪酸和酚酸化合物种类较多，分别有9和11种，但沒有甾醇类化合物提取出，可能由于乙醇极性较强，与柳兰中生物甾醇类极性相差较大所导致。乙腈是强极性提取溶剂，其提取物中脂肪酸有8种，富含不饱和脂肪酸，酚酸类化合物有8种，相比黄酮类化合物只有2种。乙酸乙酯柳兰提取出的化合物覆盖脂肪酸、酚酸、黄酮类、甾醇类、酯类、萜类和醚类，其中脂肪酸和酚酸类化合物最多，均为10种，黄酮类化合物7种，甾醇类化合物3种。正丁醇提取物中脂肪酸的种类最多（8种），其他类别的化合物含量较少，但没有萜类和醚类化合物。石油醚作为混合物提取溶剂，且易溶解脂肪，所以其提取物中脂溶性较高的脂肪酸类和黄酮类化合物较多，分别为8和5种，而水溶性较高的酚酸类化合物仅提取出2种。 柳兰不同溶剂提取液中脂肪酸、酚酸、黄酮和甾醇类四大类化合物的含量差异较大，如图2所示。蒸馏水、70%乙醇、100%乙醇、乙腈、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚7种提取剂中脂肪酸含量占各自总量的比例均为最高，分别为40.27%、77.64%、78.28%、38.18%、44.80%、88.73%和83.41%，其中乙腈、蒸馏水极性过强，所提取的脂肪酸含量较低;乙酸乙酯由于结构与脂肪酸类成分差异较大，相容性相对较低。7种溶剂柳兰提取成分相比较，除脂肪酸以外，提取物中酚酸类化合物含量最高的是蒸馏水提取液，含量为18.15%，其次是70%乙醇，含量为13.30%，乙酸乙酯和100%乙醇提取液中再次之，主要由于酚酸类化合物水溶性较强，所以在蒸馏水和70%乙醇提取液中含量较高。黄酮类化合物乙酸-乙酯提取液中含量最高（3.59%），70%乙醇提取液中次之，为2.91%。甾醇类化合物含量则是乙腈提取液中最高，达22.03%，然后是乙酸乙酯中含有8.27%以及70%乙醇中含有7.91%。100%乙醇提取物中除脂肪酸以外只有酚酸类化合物含量较高，为8.82%。正丁醇提取物中酚酸类、黄酮类和甾醇类化合物含量均偏低。石油醚提取物中明显脂溶性成分含量更高，酚酸类化合物只有5.95%。
3 讨论
该试验通过蒸馏水、70%乙醇、100%乙醇、乙腈、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚7种溶剂提取柳兰全草，结合Tof自建库对比分析发现不同溶剂的提取液中检测出的化学成分的种类、数量及含量均有显著差异。经分析得出柳兰共有57种化学成分，主要分为脂肪酸、酚酸、黃酮和甾醇类4类化合物（酯类、萜类、醚类含量相对较少），其中脂肪酸类成分含量最高。除脂肪酸外，酚酸含量蒸馏水提取液中较高，70%乙醇提取液中次之，黄酮类化合物在乙酸乙酯提取物中含量较高，甾醇类化合物乙腈提取液中较高。正丁醇提取物中酚酸、黄酮和甾醇类含量均较低。根据提取溶液中不同成分种类的数量和含量对比，脂肪酸在弱极性且结构相似的正丁醇和石油醚溶剂中提取含量更高;蒸馏水-70%乙醇-100%乙醇3种溶剂是由无机溶剂到有机溶剂的过渡，从提取成分看脂溶性脂肪酸数量和含量依次增加，但水溶性酚酸类化合物含量在逐渐降低。
近年来研究表明，柳兰有抗炎、抑菌、镇痛、抗氧化、抗病毒等药效[7-9，13-17]，而天然产物的提取物中脂肪酸、酚酸、黄酮和甾醇等化合物的一些功效已有相当数量的报道。如脂肪酸和甾醇类化合物有抗氧化作用[18-22]，酚酸类化合物有抗炎、抑菌、抑制血脂等作用[22-25];黄酮类物质有镇痛、抗癌、抑制血栓等功效[25-29]。结合该研究结果，柳兰中具有抗炎抑菌效果的化学成分极有可能为酚酸类化合物，具有抗氧化作用的可能是脂肪酸和甾醇类化合物，具有镇痛、抗病毒功效的成分则为黄酮类化合物。由于正丁醇和石油醚提取物中脂肪酸含量分别为88.73%和83.41%，且均有一定量甾醇类化合物提取出，所以柳兰用于抗氧化功效时选正丁醇或石油醚作提取剂最佳;蒸馏水和70%乙醇提取物中脂肪酸含量较大且酚酸含量较大，是柳兰用于抗炎抑菌、抗氧化等功效作用时最佳提取剂;乙酸乙酯提取物中脂肪酸、酚酸和甾醇含量均有明显占比，且黄酮类化合物种类和含量最多，适宜用于柳兰镇痛等用途;乙腈提取物中甾醇类成分含量较高，且脂肪酸、酚酸类物质均有占比，同样适用于抗氧化用途。综合7种提取溶剂的化学成分，70%乙醇提取出的脂肪酸、酚酸类、黄酮类和甾醇类成分数量较多且含量较高，且毒害作用及提取成本较低，适用多用途的提取工艺。
此外，有文献报道酚酸类物质有降血脂功效，黄酮类物质还有抗癌和抗血栓的功效[23，25-27]，而柳兰水提物、70%乙醇提取物、100%乙醇提取物和乙酸乙酯提取物中均含有多种酚酸类化合物，且乙酸乙酯提取物中含有7种黄酮类化合物，占总量的3.59%，由此可见，柳兰在降血脂和抗癌等领域有较大的开发利用前景。
参考文献
[1] 廖成松，何广礼.柳兰研究现状与展望[J].安徽农业大学学报，2016，43（4）：658-661.
[2] 芦永昌，钱帅，毛继祖，等.柳兰中总黄酮含量的测定[J].种业导刊，2016（11）：13-16.
[3] 杜品.青藏高原甘南藏药植物志[M].兰州：甘肃科学技术出版社，2006：195-196.
[4] 田静，卢永昌，曾擎毅，等.柳兰化学成分与生物活性研究进展[J].中成药，2017，39（2）：369-372.
[5] 姜守刚，吴磊，邢原首，等.柳兰不同部位的化学成分及矿质元素含量分析[J].黑龙江医药，2018，31（1）：1-4.
[6] JUAN H，SAMETZ W，HIERMANN A. Anti-inflammatory effects of a substance extracted from Epilobium angustifolium [J].Agents actions，1988，23（1/2）：106-107.
[7] DENG L Q，ZONG W，TAO X Y，et al.Evaluation of the therapeutic effect against benign prostatic hyperplasia and the active constituents from Epilobium angustifolium L.[J].Journal of ethnopharmacology，2019，232：1-10.
[8] DENG L Q，ZHOU S Y，MAO J X，et al.HPLC-ESI-MS/MS analysis of phenolics and in vitro antioxidant activity of Epilobium angustifolium L.[J].Natural product research，2018，23（12）：1432-1435. [9] SILL S，VARGA E，BEL K ，et al.Phytochemical and antimicrobial investigation of Epilobium angustifolium L.[J].Acta pharmaceutica hungarica，2014，84（3）：105-110.
[10] 马四补，李开斌，陈维，等.GC-MS联用技术对比分析黔产广东紫珠叶与果实挥发性化学成分及含量[J].中药材，2019，42（5）：1066-1070.
[11] KUKINA T P，FROLOVA T S，SAL′NIKOVA O I.Neutral constituents of Chamaenerion angustifolium leaves[J].Chemistry of natural compounds，2014，50（2）：233-236.
[12] 唐飞，刘美辰，敖慧.木香与川木香挥发油化学成分及抗菌活性的对比研究[J].中华中医药学刊，2020，38（6）：165-168，273.
[13] 劉娟，郝春艳，李凤伟.柳兰鞣质含量动态分析及体外抗氧化作用研究[J].黑龙江医药科学，2014，37（3）：19-21.
[14] 向雪岑.柳兰外用制剂在微创术后中的应用[C]//2016中国中西医结合学会医学美容学术年会暨第二届泛亚国际医学美容大会论文汇编.北京：中国中西医结合学会，2016：147.
[15] 向雪岑.柳兰外用制剂在皮肤急性炎症中的应用[C]//2017中国中西医结合学会医学美容专业委员会年会会议摘要.北京：中国中西医结合学会，2017：79.
[16] 高丽，彭玲芳，赵春梅，等.5种云南民族药材的用药经验及毒性和药效[J].中国药理学与毒理学杂志，2017，31（6）：503-507.
[17] 高丽娜.藏药提取物体外抗HIV-1活性研究[D].北京：北京工业大学，2017.
[18] 栾真杰，李佩佩，皮立，等.超声波提取马蔺籽油的脂肪酸组成及其抗氧化能力评价[J].中国粮油学报，2020，35（4）：77-82.
[19] 黄洁，欧阳彩群，杨森林，等.不同n-6/n-3多不饱和脂肪酸构成比对高脂饲料喂养大鼠脂联素和糖脂代谢及抗氧化能力的影响[J].卫生研究，2020，49（1）：86-91.
[20] 赵海军，魏芳，傅茂润，等.加工工艺对牡丹籽油脂肪酸成分、理化性质及抗氧化能力的影响[J].食品安全质量检测学报，2019，10（24）：8377-8381.
[21] 谢颖，金志红，朱靖，等.植物甾醇对奶牛生产性能、血液胆固醇和抗氧化能力的影响[J].中国奶牛，2020（2）：12-18.
[22] 张宇，孙波，赵晓，等.南瓜籽甾醇对SD大鼠体内抗氧化作用的影响[J].中国油脂，2019，44（7）：94-97.
[23] CHEN X N，YAO F，SONG J，et al.Protective effects of phenolic acid extract from ginseng on vascular endothelial cell injury induced by palmitate via activation of PI3K/Akt/eNOS pathway[J].Journal of food science，2020，85（3）：576-581.
[24] 彭玉帅，刘莉嘉，赵灿，等.金莲花中首次分离的一个酚酸类化合物及其抗炎和抑菌活性[J].中华中医药学刊，2015，33（6）：1349-1351.
[25] 刘海梅.白花丹参中丹参酮类和酚酸类化合物抗血栓活性评价及机制研究[D].济南：山东大学，2018.
[26] 唐琴.黄酮类化合物与羟基喜树碱的联合抗癌作用及机理研究[D].大连：大连理工大学，2017.
[27] 王博，林圣云.含黄酮类中药的抗癌抗肿瘤作用研究概况[J].浙江中医药大学学报，2012，36（7）：838-840.
[28] 陈虎.药桑椹总黄酮的抗炎镇痛活性研究[D].重庆：西南大学，2018.
[29] 杨兴海，孔劲松.生物黄酮类化合物对心血管、消化系统及镇痛作用的研究进展[J].时珍国医国药，2007，18（5）：1242-1243.
关键词 柳兰;提取溶剂;化成成分;差异比较
中图分类号 R 284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）19-0151-06
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.19.040
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Effects of Different Extraction Solvents on the Chemical Composition of Epilobium angustifolium L.
HAN Yang-yang1，2，LIAO Cheng-song1，2
（1.Xilingol Bioengineering Research Institute， Xilinghot，Inner Mongolia 026000;2.Xilingol Vocational College， Xilinghot，Inner Mongolia 026000）
Abstract By comparing and analyzing the differences of chemical components in different solvent extracts， the best extraction solvent was selected. 7 extraction solvents （distilled water， 70% ethanol， 100% ethanol， acetonitrile， ethyl acetate， n-butanol and petroleum ether） were used to extract the whole grass powder of Epilobium angustifolium ， and the chemical components of the extract were identified and analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry QTOF. The results showed that there were 57 kinds of chemical components in the 7 different solvents， mainly including fatty acids， phenolic acids， flavonoids and alcohols. The highest content was fatty acids， and there was only one common chemical component palmitic acid. The quantity， species and content of the chemical components in the extracts of different solvents were obviously different. It could be seen that the extraction solvent had a great influence on the chemical components of plant extracts. According to the known main pharmacological effects of Epilobium angustifolium ， n-butanol and petroleum ether were suitable for antioxidant extraction solvent， water and 70% ethanol were suitable for anti-inflammatory and bacteriostatic extracts， and ethyl acetate was suitable for analgesic and anticancer extracts. Considering the pharmacological effects， side effects and production process cost， 70% ethanol could be a common solvent for Epilobium angustifolium extraction.
Key words Epilobium angustifolium L.;Extraction solvent;Chemical composition;Difference comparison
基金项目 锡林郭勒职业学院课题（ZD-2020-03）;内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY19339）。 作者简介 韩阳阳（1989—），女，河北丰宁人，工程师，硕士，从事天然产物分析及代谢机理研究。*通信作者，副教授，博士，从事野生药用植物驯化栽培和民族药方剂与成分分析研究。
收稿日期 2021-03-22
柳兰（ Epilobium angustifolium L.）是多年粗壮草本，直立，丛生，又名红筷子、遍山红[1]。柳兰属于喜光植物，一般野生于草地、林缘、高山草甸、河滩、砾石坡等地，性耐寒，耐贫瘠，广泛分布于北温带与寒带地区，在我国柳兰多分布于四川、西藏、云南等地。柳兰作为传统中草药，味苦，性平，有小毒，多见于青藏地区[2]。据《青藏高原甘南藏药植物志》等记载，柳兰具有镇痛、活血作用，且可治疗肠胃疾病[3]。柳兰在现代研究中，具有抗炎、抗菌、抗焦虑、抗氧化、抑制前列腺细胞增殖、免疫调节等药理作用[4]。随着科学水平的不断发展，从药用原材料中提取主要成分的技术不断精进，而这其中溶剂的选择至关重要，因为不同提取溶剂对不同成分的浸出往往起决定性作用[5，10-12]。笔者分别用蒸馏水、70%乙醇、100%乙醇、乙腈、乙酸乙酯、正丁醇和石油醚7种不同溶剂对柳兰全草粉末进行浸提，用液质联用QTof对提取液的化学成分进行鉴定和分析，比较不同溶剂提取液中柳兰化学成分的差异，筛选出柳兰入药的最佳提取溶剂，为后续柳兰成药开发提供方法指导。
1 材料与方法
1.1 仪器
G2-XS QTof液质联用仪（Waters，美国）;FW100研磨机（天津泰斯特仪器有限公司）;BY-30AD超声萃取仪（上海秉越电子仪器有限公司）;AXTG16G离心机（盐城市安信实验仪器有限公司）;HSC-24B氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）。
1.2 试材
柳兰全草（从内蒙古锡林浩特市柳兰沟采集，经内蒙古大学胡日查教授鉴定）;乙醇（HPLC，北京迈瑞达科技有限公司）;乙腈（HPLC，北京迈瑞达科技有限公司）;正丁醇（HPLC，天津市康科德科技有限公司）;乙酸乙酯（HPLC，北京迈瑞达科技有限公司）;石油醚（AR，国药集团化学试剂有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 柳兰化学成分的提取。取柳兰全草晾干，研磨成粉，4 ℃冰箱备用。取柳兰粉0.1 g于1.5 mL离心管内，分别加入提取溶剂蒸馏水、70%乙醇、100%乙醇、乙腈、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚1 mL，30 ℃超声提取30 min后，于12 000 r/min离心10 min，取上层清液氮吹干后，用乙腈复溶上机。
1.3.2 QTof液质联用条件。色谱柱为Waters ACQUIY UPLC BEH Shield RP18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相A为水（含0.1%甲酸），B为乙腈（含0.1%甲酸），梯度：0 → 8.0 min，80% B;8.0→ 10.0 min，80% → 100% B;10.0→ 12.0 min，100% B;12.0→ 12.1 min，100% → 20% B;12.1→14.0 min，20% B;14.0→17.0 min，100% B;17.0→18.2 min，100%→80% B;18.2 → 25.0 min，80% B;流速0.4 mL/min，柱温 40 ℃，Tof采集为正离子模式，质量检测范围为100～1 200 Da;毛细管电压为3 kV;样品锥电压为40 V;萃取锥电压为4 V;离子源温度为100 ℃;去溶剂温度为400 ℃;去溶剂化气体为800 L/h，锁定质量为556.276 6（正离子模式）。准确度误差阈值固定在5 mDa。数据采集由MassLynx 4.1软件控制。
2 结果与分析
2.1 柳兰不同溶剂提取液中化学成分分析
根据“1.3.1”方法，蒸馏水、70%乙醇、100%乙醇、乙腈、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚提取柳兰的总离子流图如图1所示。经Tof自建库分析，以上几种溶剂提取柳兰化学成分如表1所示。
天然草药化学成分复杂，柳兰经不同溶剂提取后，提取液经Tof法分析，由表1可知，共得到57种化合物。其中蒸馏水提取化学成分20种，山奈酚-8-O-甲基醚含量最高，为29.82%，其次是辛酸、亚油酸等脂肪酸类化合物以及酚酸类化合物，其中3-O-阿魏酰奎宁酸等含量较高。70%乙醇检测出化学成分24种，含量最高的是硬脂酸（57.89%），其次分别是肉豆蔻酸（16.51%）和山奈酚（12.63%）。100%乙醇提取柳兰化学成分26种，含量以脂肪酸中肉豆蔻酸（45.66%）为最高，而亚麻酸含量也高达16.81%。乙腈提取柳兰化合物检测出27种成分，山奈酚-8-O-甲基醚含量最高，为19.25%，其次为花生酸和豆甾醇，含量分别为14.83%和12.51%。7种溶剂中乙酸乙酯提取液中柳兰化学成分最多，为33种，含量最高为萜类化合物齐墩果酸26.43%，而脂肪酸中除肉豆蔻酸外，还分析得到花生酸、二十四酸等物质。正丁醇提取物中含化合物19种，以硬脂酸含量最高，为61.48%，其酯类化合物己酸-β-谷甾醇酯含量为5.08%。石油醚是混合物，提取出柳兰成分18种，其中含量最高的为硬脂酸（60.65%），脂肪酸中油酸的含量占11.34%。不同溶剂提取液中柳兰的化学成分差异较大，7种溶剂提取出的相同化学成分仅有棕榈酸一种，按上述顺序含量分别为1.82%、0.24%、9.06%、7.91%、3.95%、1.75%、7.29%。
2.2 柳兰不同溶剂提取液中化学成分功能分类与差异比较
将不同溶剂提取物中鉴定到的柳兰化学成分按功能进行分类，结果如表2所示。由表2可知，提取液中所含化学物质主要是脂肪酸、酚酸类、黄酮类及甾醇类4大类化合物，另外有少量的酯类化合物，萜类化合物只有一种齐墩果酸，而醚类化合物只有山奈酚-8-O-甲基醚。结合表2和表3，蒸馏水提取物中酚酸类化合物最多，有9种，没有提取出黄酮类化合物，可能由于蒸馏水为无机溶剂，与黄酮类化合物相容性较低所影响。70%乙醇是有机-无机两相混合提取溶剂，其柳兰提取物中有7种脂肪酸和7种酚酸类化合物，与其他溶剂提取物相比，黄酮类和甾醇类化合物较多，种类比较齐全。100%乙醇提取物中脂肪酸和酚酸化合物种类较多，分别有9和11种，但沒有甾醇类化合物提取出，可能由于乙醇极性较强，与柳兰中生物甾醇类极性相差较大所导致。乙腈是强极性提取溶剂，其提取物中脂肪酸有8种，富含不饱和脂肪酸，酚酸类化合物有8种，相比黄酮类化合物只有2种。乙酸乙酯柳兰提取出的化合物覆盖脂肪酸、酚酸、黄酮类、甾醇类、酯类、萜类和醚类，其中脂肪酸和酚酸类化合物最多，均为10种，黄酮类化合物7种，甾醇类化合物3种。正丁醇提取物中脂肪酸的种类最多（8种），其他类别的化合物含量较少，但没有萜类和醚类化合物。石油醚作为混合物提取溶剂，且易溶解脂肪，所以其提取物中脂溶性较高的脂肪酸类和黄酮类化合物较多，分别为8和5种，而水溶性较高的酚酸类化合物仅提取出2种。 柳兰不同溶剂提取液中脂肪酸、酚酸、黄酮和甾醇类四大类化合物的含量差异较大，如图2所示。蒸馏水、70%乙醇、100%乙醇、乙腈、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚7种提取剂中脂肪酸含量占各自总量的比例均为最高，分别为40.27%、77.64%、78.28%、38.18%、44.80%、88.73%和83.41%，其中乙腈、蒸馏水极性过强，所提取的脂肪酸含量较低;乙酸乙酯由于结构与脂肪酸类成分差异较大，相容性相对较低。7种溶剂柳兰提取成分相比较，除脂肪酸以外，提取物中酚酸类化合物含量最高的是蒸馏水提取液，含量为18.15%，其次是70%乙醇，含量为13.30%，乙酸乙酯和100%乙醇提取液中再次之，主要由于酚酸类化合物水溶性较强，所以在蒸馏水和70%乙醇提取液中含量较高。黄酮类化合物乙酸-乙酯提取液中含量最高（3.59%），70%乙醇提取液中次之，为2.91%。甾醇类化合物含量则是乙腈提取液中最高，达22.03%，然后是乙酸乙酯中含有8.27%以及70%乙醇中含有7.91%。100%乙醇提取物中除脂肪酸以外只有酚酸类化合物含量较高，为8.82%。正丁醇提取物中酚酸类、黄酮类和甾醇类化合物含量均偏低。石油醚提取物中明显脂溶性成分含量更高，酚酸类化合物只有5.95%。
3 讨论
该试验通过蒸馏水、70%乙醇、100%乙醇、乙腈、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚7种溶剂提取柳兰全草，结合Tof自建库对比分析发现不同溶剂的提取液中检测出的化学成分的种类、数量及含量均有显著差异。经分析得出柳兰共有57种化学成分，主要分为脂肪酸、酚酸、黃酮和甾醇类4类化合物（酯类、萜类、醚类含量相对较少），其中脂肪酸类成分含量最高。除脂肪酸外，酚酸含量蒸馏水提取液中较高，70%乙醇提取液中次之，黄酮类化合物在乙酸乙酯提取物中含量较高，甾醇类化合物乙腈提取液中较高。正丁醇提取物中酚酸、黄酮和甾醇类含量均较低。根据提取溶液中不同成分种类的数量和含量对比，脂肪酸在弱极性且结构相似的正丁醇和石油醚溶剂中提取含量更高;蒸馏水-70%乙醇-100%乙醇3种溶剂是由无机溶剂到有机溶剂的过渡，从提取成分看脂溶性脂肪酸数量和含量依次增加，但水溶性酚酸类化合物含量在逐渐降低。
近年来研究表明，柳兰有抗炎、抑菌、镇痛、抗氧化、抗病毒等药效[7-9，13-17]，而天然产物的提取物中脂肪酸、酚酸、黄酮和甾醇等化合物的一些功效已有相当数量的报道。如脂肪酸和甾醇类化合物有抗氧化作用[18-22]，酚酸类化合物有抗炎、抑菌、抑制血脂等作用[22-25];黄酮类物质有镇痛、抗癌、抑制血栓等功效[25-29]。结合该研究结果，柳兰中具有抗炎抑菌效果的化学成分极有可能为酚酸类化合物，具有抗氧化作用的可能是脂肪酸和甾醇类化合物，具有镇痛、抗病毒功效的成分则为黄酮类化合物。由于正丁醇和石油醚提取物中脂肪酸含量分别为88.73%和83.41%，且均有一定量甾醇类化合物提取出，所以柳兰用于抗氧化功效时选正丁醇或石油醚作提取剂最佳;蒸馏水和70%乙醇提取物中脂肪酸含量较大且酚酸含量较大，是柳兰用于抗炎抑菌、抗氧化等功效作用时最佳提取剂;乙酸乙酯提取物中脂肪酸、酚酸和甾醇含量均有明显占比，且黄酮类化合物种类和含量最多，适宜用于柳兰镇痛等用途;乙腈提取物中甾醇类成分含量较高，且脂肪酸、酚酸类物质均有占比，同样适用于抗氧化用途。综合7种提取溶剂的化学成分，70%乙醇提取出的脂肪酸、酚酸类、黄酮类和甾醇类成分数量较多且含量较高，且毒害作用及提取成本较低，适用多用途的提取工艺。
此外，有文献报道酚酸类物质有降血脂功效，黄酮类物质还有抗癌和抗血栓的功效[23，25-27]，而柳兰水提物、70%乙醇提取物、100%乙醇提取物和乙酸乙酯提取物中均含有多种酚酸类化合物，且乙酸乙酯提取物中含有7种黄酮类化合物，占总量的3.59%，由此可见，柳兰在降血脂和抗癌等领域有较大的开发利用前景。
参考文献
[1] 廖成松，何广礼.柳兰研究现状与展望[J].安徽农业大学学报，2016，43（4）：658-661.
[2] 芦永昌，钱帅，毛继祖，等.柳兰中总黄酮含量的测定[J].种业导刊，2016（11）：13-16.
[3] 杜品.青藏高原甘南藏药植物志[M].兰州：甘肃科学技术出版社，2006：195-196.
[4] 田静，卢永昌，曾擎毅，等.柳兰化学成分与生物活性研究进展[J].中成药，2017，39（2）：369-372.
[5] 姜守刚，吴磊，邢原首，等.柳兰不同部位的化学成分及矿质元素含量分析[J].黑龙江医药，2018，31（1）：1-4.
[6] JUAN H，SAMETZ W，HIERMANN A. Anti-inflammatory effects of a substance extracted from Epilobium angustifolium [J].Agents actions，1988，23（1/2）：106-107.
[7] DENG L Q，ZONG W，TAO X Y，et al.Evaluation of the therapeutic effect against benign prostatic hyperplasia and the active constituents from Epilobium angustifolium L.[J].Journal of ethnopharmacology，2019，232：1-10.
[8] DENG L Q，ZHOU S Y，MAO J X，et al.HPLC-ESI-MS/MS analysis of phenolics and in vitro antioxidant activity of Epilobium angustifolium L.[J].Natural product research，2018，23（12）：1432-1435. [9] SILL S，VARGA E，BEL K ，et al.Phytochemical and antimicrobial investigation of Epilobium angustifolium L.[J].Acta pharmaceutica hungarica，2014，84（3）：105-110.
[10] 马四补，李开斌，陈维，等.GC-MS联用技术对比分析黔产广东紫珠叶与果实挥发性化学成分及含量[J].中药材，2019，42（5）：1066-1070.
[11] KUKINA T P，FROLOVA T S，SAL′NIKOVA O I.Neutral constituents of Chamaenerion angustifolium leaves[J].Chemistry of natural compounds，2014，50（2）：233-236.
[12] 唐飞，刘美辰，敖慧.木香与川木香挥发油化学成分及抗菌活性的对比研究[J].中华中医药学刊，2020，38（6）：165-168，273.
[13] 劉娟，郝春艳，李凤伟.柳兰鞣质含量动态分析及体外抗氧化作用研究[J].黑龙江医药科学，2014，37（3）：19-21.
[14] 向雪岑.柳兰外用制剂在微创术后中的应用[C]//2016中国中西医结合学会医学美容学术年会暨第二届泛亚国际医学美容大会论文汇编.北京：中国中西医结合学会，2016：147.
[15] 向雪岑.柳兰外用制剂在皮肤急性炎症中的应用[C]//2017中国中西医结合学会医学美容专业委员会年会会议摘要.北京：中国中西医结合学会，2017：79.
[16] 高丽，彭玲芳，赵春梅，等.5种云南民族药材的用药经验及毒性和药效[J].中国药理学与毒理学杂志，2017，31（6）：503-507.
[17] 高丽娜.藏药提取物体外抗HIV-1活性研究[D].北京：北京工业大学，2017.
[18] 栾真杰，李佩佩，皮立，等.超声波提取马蔺籽油的脂肪酸组成及其抗氧化能力评价[J].中国粮油学报，2020，35（4）：77-82.
[19] 黄洁，欧阳彩群，杨森林，等.不同n-6/n-3多不饱和脂肪酸构成比对高脂饲料喂养大鼠脂联素和糖脂代谢及抗氧化能力的影响[J].卫生研究，2020，49（1）：86-91.
[20] 赵海军，魏芳，傅茂润，等.加工工艺对牡丹籽油脂肪酸成分、理化性质及抗氧化能力的影响[J].食品安全质量检测学报，2019，10（24）：8377-8381.
[21] 谢颖，金志红，朱靖，等.植物甾醇对奶牛生产性能、血液胆固醇和抗氧化能力的影响[J].中国奶牛，2020（2）：12-18.
[22] 张宇，孙波，赵晓，等.南瓜籽甾醇对SD大鼠体内抗氧化作用的影响[J].中国油脂，2019，44（7）：94-97.
[23] CHEN X N，YAO F，SONG J，et al.Protective effects of phenolic acid extract from ginseng on vascular endothelial cell injury induced by palmitate via activation of PI3K/Akt/eNOS pathway[J].Journal of food science，2020，85（3）：576-581.
[24] 彭玉帅，刘莉嘉，赵灿，等.金莲花中首次分离的一个酚酸类化合物及其抗炎和抑菌活性[J].中华中医药学刊，2015，33（6）：1349-1351.
[25] 刘海梅.白花丹参中丹参酮类和酚酸类化合物抗血栓活性评价及机制研究[D].济南：山东大学，2018.
[26] 唐琴.黄酮类化合物与羟基喜树碱的联合抗癌作用及机理研究[D].大连：大连理工大学，2017.
[27] 王博，林圣云.含黄酮类中药的抗癌抗肿瘤作用研究概况[J].浙江中医药大学学报，2012，36（7）：838-840.
[28] 陈虎.药桑椹总黄酮的抗炎镇痛活性研究[D].重庆：西南大学，2018.
[29] 杨兴海，孔劲松.生物黄酮类化合物对心血管、消化系统及镇痛作用的研究进展[J].时珍国医国药，2007，18（5）：1242-1243.