【摘 要】
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目的构建抗bcr/abl mRNA的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)表达载体,转染K562细胞,检测诱导细胞凋亡的变化.方法参照siRNA模板设计原则,设计并合成两条siRNA模板序
【机 构】
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上海,上海市血液中心,复旦大学基础医学院分子病毒学教育部重点实验室
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目的构建抗bcr/abl mRNA的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)表达载体,转染K562细胞,检测诱导细胞凋亡的变化.方法参照siRNA模板设计原则,设计并合成两条siRNA模板序列,将其插入质粒pSilencer1.0-U6中得到重组子pBCR6,通过限制性酶切和测序鉴定,大量制备、纯化;以X-tremeGENE Q2介导瞬时转染K562细胞,设置空载体作为对照.在转染后不同时间,利用原位缺口末端标记法(TUNEL)、膜联蛋白Ⅴ+碘化丙锭染色法(AnnexinⅤ/PI)通过流式细胞仪检测K562细胞凋亡的变化. 结果针对bcr/abl mRNA融合区域设计的siRNA模板序列,经筛选合成寡核苷酸链后退火形成双链,再插入pSilencer1.0-U6,经酶切和测序鉴定提示构建成功;大量制备、纯化后进行转染,在转染后48,72 h TUNEL法检测和AnnexinⅤ/PI染色法均显示抗bcr/abl mRNA的siRNA表达载体可有效诱导K562细胞凋亡,且随转染时间的延长凋亡率增高[转染pBCR6 72 h的K562细胞凋亡率为(47.80±1.63)%],与对照组[(6.67±0.37)%]比较差异有显著性(P
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