论文部分内容阅读
【摘 要】合成甾体激素类药物不可替代的中间体是雄烯二酮（AD），日益枯竭的薯芋皂素资源是导致生物学家们不断尝试寻找用微生物发酵产生AD的重要因素。植物甾醇可由菌株Mycobacteriumsp.BD696-6(简称BD696-6)转化为雄烯二酮。由于菌体浓度低、发酵周期长、转化率低等缺点存在于发酵过程中，人们开始积极研究固定化技术对分支杆菌BD696-6的影响。由研究数据可知固定化技术可以有效保护细胞膜的完整性，有效提高目标产物的积累量。通过研究海藻酸钠包埋法和硅藻土吸附法固定菌体细胞，探索固定化条件及发酵条件对分枝杆菌BD696-6发酵产生AD的影响。
【关键词】细胞固定化；海藻酸钠；硅藻土；发酵条件；雄烯二酮
大部分的甾体激素类药物的生产都是以AD为起始原料的，而雄烯二酮（雄甾-4-烯-3,17二酮，简称AD）是合成甾体激素类药物不可替代的中间体。我们既可以用化学方法从野生药材“穿地龙”中植物提取合成AD，也可以通过降解自然界丰富的动植物甾醇用微生物发酵的方法获得AD。日益枯竭的薯芋皂素资源使薯芋皂素越来越昂贵，用微生物发酵技术生产AD成了发展甾体药物的一大趋势。用这种方法我们不仅可以摆脱“穿地龙”黄姜等原料供应受季节、地域等自然因素的影响及其对生产造成的制约，还可以满足国内外市场日益增长的对AD的需求，更起了保护自然资源和生态资源乃至人类健康的重大作用。
1.雄烯二酮的结构、性质及生产方法
1.1结构与性质
雄烯二酮的结构式如图所示，分子式为C19H26O2，分子量为286.45，熔点是173~174℃，白色晶體粉末状，无异味，无毒性，可燃，溶于乙醇、醋酸、乙醚等有机溶剂，不溶于水。
1.2应用雄烯二酮
雄性激素、蛋白同化激素、螺内酯等药物主要是由AD生产，雄烯二酮的中间体地位是许多甾体药物不可替代的，对机体起着非常重要的调节作用。合成19－去甲甾体系列雌激素的重要前体物是AD的类似物ADD，有了AD和ADD我们我们可以合成大部分的甾类药物。根据研究表明，细胞膜的完整性可以由细胞固定化保护，细胞固定化还可以增强积累目标产物的能力。
1.3雄烯二酮的生产方法
1.3.1传统生产方法(化学合成法)
由薯蓣植物资源中提取薯蓣皂苷元，化学合成雄烯二酮，然后再以雄烯二酮为中间体合成多种甾体药物。化学合成法有着复杂的化学工艺，繁琐的步骤，高价的成本（总成本不下于1000元/公斤），不仅消耗量大还破坏环境等的局限性，人们一直致力于寻找如胆酸、海柯皂苷元和惕告皂苷元等新的天然甾体药物，将其开发成制造雄烯二酮的原料。
1.3.2微生物转化法
利用微生物细胞对有机化合物某一特定部位作用，将其转化为结构上相类似的另一种化合物的方法称为微生物转化。利用微生物细胞的酶系对底物的某一特定部位进行催化反应形成最终产物，而不是由营养物质经微生物细胞的一系列代酶过程后转化的。微生物转化法如图所示：
自生产开始实行微生物转化后，甾体药物就常采用化学法和微生物转化法相结合的办法来生产。这样可以减少合成步骤、缩短生产周期、提高收获率，减少发生副反应。
2.对分枝杆菌BD696-6产雄烯二酮的现状研究
关于分枝杆菌发酵产生AD的研究是目前国内外热衷的课题之一。其主要集中下面的方面：
2.1菌种的选育
发酵过程的控制及产量直接由菌种的优良来决定的，菌种的优良是影响发酵过程至关重要的元素。
2.2添加抑制剂、优化培养基
经过研究邻菲罗啉等酶抑制剂对积累ADD的影响，为防止甾核降解我们可以适当添加抑制剂。添加时间是非常重要的，因为抑制剂也有轻微抑制甾醇降解酶的作用。且要将浓度控制到最佳。优化培养基方面：哈尔滨理工大学的车成彬等发现“葡萄糖为碳源不如玉米浆为碳源产率高，并且磷酸盐充足能提高产率”。总的来说，培养基优化后，在0.2%~0.3%的投料浓度时，一般能将转化率提高到50%。但转化率会下降如果再增加底物投料浓度。
2.3利用化学或物理手段将微生物自然固定或定位于限定的空间区域内，保护其固有的催化活性，并能反复使用的技术称为细胞固定化技术
由于固定化生物细胞可以持续增殖、休眠及衰亡，所以其活性一直保持稳定。除保持原有的识别、结合、催化活性外，固定化的生物细胞还具有易于分离、可重复使用及稳定性提高等显著优点。
3.对分枝杆菌BD696-6产雄烯二酮的研究
3.1海藻酸钠固定BD696-6菌株转化甾醇产雄烯二酮
将微生物细胞包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜聚合物的超滤膜内的方法称为包埋法。由于有着化学稳定性好、无毒、包埋效率高且价格低廉等优点，海藻酸盐成为广泛运用的包埋固定化介质。用海藻酸钠包埋菌体，研究在不同包埋菌体量下形成凝胶的特性时的海藻酸钠、氯化钙的浓度，经由正交试验考察凝胶强度、贮藏稳定性以及其对发酵的影响，并找到最适合进行固体化细胞发酵的条件。
考察了固定化细胞的包埋条件对AD转化率的影响，研究了包埋条件下海藻酸钠的浓度、氯化钙浓度及菌体包埋量后，通过正交分析法得到海藻酸钙固定化细胞的最佳包埋条件：海藻酸钠浓度为2g/100mL、氯化钙浓度为1g/100mL、菌体包埋量为15mL/50mL凝胶。缩短了24h的发酵周期，提高了17.93%的AD转化率。
3.2硅藻土吸附法
吸附法又被称为载体结合法，通过自然附着力（物理吸附、离子结合）等方式将微生物细胞固定在载体表面和内部形成生物膜。在确定硅藻土为吸附BD696-6细胞的载体后，在建立单因素实验的基础上，通过正交试验优化得到硅藻土吸附菌株条件：载体添加量7g/L,最佳接种量18%，甾醇添加量3g/L、发酵时间168h，但这种固定化体系发酵转化的重复性不太好。
（1）硅藻土吸附细胞的发酵条件为：pH8.7，发酵温度32℃，摇床转速200r/min；添加铁锌镁等金属离子可提高AD的转化率达85.64%；甘氨酸可抑制BD696-6细胞壁的合成，提高细胞转化活性。
（2）5L罐发酵进行放大培养可以提高AD转化率，验证了摇瓶发酵的结果。甾醇的含量能提高总产量弥补了其会降低AD的转化率的不足。
合成甾体激素类药物不可替代的中间体是雄烯二酮（AD），日益枯竭的薯芋皂素资源是导致生物学家们不断尝试寻找用微生物发酵产生AD的重要因素。植物甾醇可由菌株Mycobacteriumsp.BD696-6(简称BD696-6)转化为雄烯二酮。由于菌体浓度低、发酵周期长、转化率低等缺点存在于发酵过程中，总之，由于固定化发酵体系可以重复利用，我们可以用固定化技术发酵产生雄烯二酮。微生物转化植物甾醇为雄烯二酮的过程是一个多酶体系参与的生化反应过程。其中涉及到植物甾醇从胞外到胞内的运输、从胞内到反应点的运送、植物甾醇侧链切除的酶的调控和雄烯二酮双键和羟基的形成的酶的调控等。在以后发展中，可以从根源上（如基因调控方面）获得更大进展，为以后实行大规模工业化生产提供理论依据。
【参考文献】
［１］姜绍通，赵俊平，杨英等．两相系统发酵转化植物甾醇为雄烯二酮的研究[J]．食品与发酵工业，200834（36）；46-49.
［２］张裕卿，王冬青．植物甾醇微生物转化制备甾体药物中间体的研究进展[J]．工业微生物，2006,33（2）：142-146.
［３］丁志遵．天然甾体药物原料开拓利用的回顾和展望[J]．中草药，1985,16（6）：28-36.
【关键词】细胞固定化；海藻酸钠；硅藻土；发酵条件；雄烯二酮
大部分的甾体激素类药物的生产都是以AD为起始原料的，而雄烯二酮（雄甾-4-烯-3,17二酮，简称AD）是合成甾体激素类药物不可替代的中间体。我们既可以用化学方法从野生药材“穿地龙”中植物提取合成AD，也可以通过降解自然界丰富的动植物甾醇用微生物发酵的方法获得AD。日益枯竭的薯芋皂素资源使薯芋皂素越来越昂贵，用微生物发酵技术生产AD成了发展甾体药物的一大趋势。用这种方法我们不仅可以摆脱“穿地龙”黄姜等原料供应受季节、地域等自然因素的影响及其对生产造成的制约，还可以满足国内外市场日益增长的对AD的需求，更起了保护自然资源和生态资源乃至人类健康的重大作用。
1.雄烯二酮的结构、性质及生产方法
1.1结构与性质
雄烯二酮的结构式如图所示，分子式为C19H26O2，分子量为286.45，熔点是173~174℃，白色晶體粉末状，无异味，无毒性，可燃，溶于乙醇、醋酸、乙醚等有机溶剂，不溶于水。
1.2应用雄烯二酮
雄性激素、蛋白同化激素、螺内酯等药物主要是由AD生产，雄烯二酮的中间体地位是许多甾体药物不可替代的，对机体起着非常重要的调节作用。合成19－去甲甾体系列雌激素的重要前体物是AD的类似物ADD，有了AD和ADD我们我们可以合成大部分的甾类药物。根据研究表明，细胞膜的完整性可以由细胞固定化保护，细胞固定化还可以增强积累目标产物的能力。
1.3雄烯二酮的生产方法
1.3.1传统生产方法(化学合成法)
由薯蓣植物资源中提取薯蓣皂苷元，化学合成雄烯二酮，然后再以雄烯二酮为中间体合成多种甾体药物。化学合成法有着复杂的化学工艺，繁琐的步骤，高价的成本（总成本不下于1000元/公斤），不仅消耗量大还破坏环境等的局限性，人们一直致力于寻找如胆酸、海柯皂苷元和惕告皂苷元等新的天然甾体药物，将其开发成制造雄烯二酮的原料。
1.3.2微生物转化法
利用微生物细胞对有机化合物某一特定部位作用，将其转化为结构上相类似的另一种化合物的方法称为微生物转化。利用微生物细胞的酶系对底物的某一特定部位进行催化反应形成最终产物，而不是由营养物质经微生物细胞的一系列代酶过程后转化的。微生物转化法如图所示：
自生产开始实行微生物转化后，甾体药物就常采用化学法和微生物转化法相结合的办法来生产。这样可以减少合成步骤、缩短生产周期、提高收获率，减少发生副反应。
2.对分枝杆菌BD696-6产雄烯二酮的现状研究
关于分枝杆菌发酵产生AD的研究是目前国内外热衷的课题之一。其主要集中下面的方面：
2.1菌种的选育
发酵过程的控制及产量直接由菌种的优良来决定的，菌种的优良是影响发酵过程至关重要的元素。
2.2添加抑制剂、优化培养基
经过研究邻菲罗啉等酶抑制剂对积累ADD的影响，为防止甾核降解我们可以适当添加抑制剂。添加时间是非常重要的，因为抑制剂也有轻微抑制甾醇降解酶的作用。且要将浓度控制到最佳。优化培养基方面：哈尔滨理工大学的车成彬等发现“葡萄糖为碳源不如玉米浆为碳源产率高，并且磷酸盐充足能提高产率”。总的来说，培养基优化后，在0.2%~0.3%的投料浓度时，一般能将转化率提高到50%。但转化率会下降如果再增加底物投料浓度。
2.3利用化学或物理手段将微生物自然固定或定位于限定的空间区域内，保护其固有的催化活性，并能反复使用的技术称为细胞固定化技术
由于固定化生物细胞可以持续增殖、休眠及衰亡，所以其活性一直保持稳定。除保持原有的识别、结合、催化活性外，固定化的生物细胞还具有易于分离、可重复使用及稳定性提高等显著优点。
3.对分枝杆菌BD696-6产雄烯二酮的研究
3.1海藻酸钠固定BD696-6菌株转化甾醇产雄烯二酮
将微生物细胞包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜聚合物的超滤膜内的方法称为包埋法。由于有着化学稳定性好、无毒、包埋效率高且价格低廉等优点，海藻酸盐成为广泛运用的包埋固定化介质。用海藻酸钠包埋菌体，研究在不同包埋菌体量下形成凝胶的特性时的海藻酸钠、氯化钙的浓度，经由正交试验考察凝胶强度、贮藏稳定性以及其对发酵的影响，并找到最适合进行固体化细胞发酵的条件。
考察了固定化细胞的包埋条件对AD转化率的影响，研究了包埋条件下海藻酸钠的浓度、氯化钙浓度及菌体包埋量后，通过正交分析法得到海藻酸钙固定化细胞的最佳包埋条件：海藻酸钠浓度为2g/100mL、氯化钙浓度为1g/100mL、菌体包埋量为15mL/50mL凝胶。缩短了24h的发酵周期，提高了17.93%的AD转化率。
3.2硅藻土吸附法
吸附法又被称为载体结合法，通过自然附着力（物理吸附、离子结合）等方式将微生物细胞固定在载体表面和内部形成生物膜。在确定硅藻土为吸附BD696-6细胞的载体后，在建立单因素实验的基础上，通过正交试验优化得到硅藻土吸附菌株条件：载体添加量7g/L,最佳接种量18%，甾醇添加量3g/L、发酵时间168h，但这种固定化体系发酵转化的重复性不太好。
（1）硅藻土吸附细胞的发酵条件为：pH8.7，发酵温度32℃，摇床转速200r/min；添加铁锌镁等金属离子可提高AD的转化率达85.64%；甘氨酸可抑制BD696-6细胞壁的合成，提高细胞转化活性。
（2）5L罐发酵进行放大培养可以提高AD转化率，验证了摇瓶发酵的结果。甾醇的含量能提高总产量弥补了其会降低AD的转化率的不足。
合成甾体激素类药物不可替代的中间体是雄烯二酮（AD），日益枯竭的薯芋皂素资源是导致生物学家们不断尝试寻找用微生物发酵产生AD的重要因素。植物甾醇可由菌株Mycobacteriumsp.BD696-6(简称BD696-6)转化为雄烯二酮。由于菌体浓度低、发酵周期长、转化率低等缺点存在于发酵过程中，总之，由于固定化发酵体系可以重复利用，我们可以用固定化技术发酵产生雄烯二酮。微生物转化植物甾醇为雄烯二酮的过程是一个多酶体系参与的生化反应过程。其中涉及到植物甾醇从胞外到胞内的运输、从胞内到反应点的运送、植物甾醇侧链切除的酶的调控和雄烯二酮双键和羟基的形成的酶的调控等。在以后发展中，可以从根源上（如基因调控方面）获得更大进展，为以后实行大规模工业化生产提供理论依据。
【参考文献】
［１］姜绍通，赵俊平，杨英等．两相系统发酵转化植物甾醇为雄烯二酮的研究[J]．食品与发酵工业，200834（36）；46-49.
［２］张裕卿，王冬青．植物甾醇微生物转化制备甾体药物中间体的研究进展[J]．工业微生物，2006,33（2）：142-146.
［３］丁志遵．天然甾体药物原料开拓利用的回顾和展望[J]．中草药，1985,16（6）：28-36.