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摘要：研究了不同酶解程度对水飞蓟蛋白理化特性（包括氨基酸组成、相对分子质量、溶解性、乳化性、乳化稳定性）的影响。结果表明：水飞蓟蛋白进行不同酶解处理后，氨基酸组成发生了变化，一些抗氧化氨基酸的含量提高，相对分子质量变小，酶解物的溶解性提高，持油性呈现先升高后降低的趋势，其中水解度5%的持油性最好，酶解物的乳化性和乳化稳定性都较酶解前有所提高。本研究结果为水飞蓟蛋白的改性提供了一定的数据支持。
关键词：水飞蓟蛋白；酶解程度；理化特性；氨基酸组成
中图分类号： TS201文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0346-02
收稿日期：2014-12-11
基金项目：江苏省镇江市农业科技支撑项目（编号：NY2012031）；江苏大学大学生科研立项资助项目（编号：13A109）；江苏大学大学生实践创新训练项目（编号：201410299169W）。
作者简介：朱淑云（1975—），女，山东青岛人， 博士，副教授，主要从事食品生物技术研究工作。E-mail：shyzhu@eyou.com。水飞蓟是一种传统的药用植物，其药用成分水飞蓟素主要存在于水飞蓟籽壳中，其籽仁中主要含有蛋白质、油脂和淀粉等物质[1]。研究发现，水飞蓟籽仁脱脂粉中蛋白质含量高达47.23%，水飞蓟蛋白以清蛋白为主，其氨基酸种类齐全，是一种优质的植物蛋白[2-3] 。然而目前国内外学者对水飞蓟的研究主要集中在对水飞蓟素的开发利用上，对水飞蓟蛋白的研究较少[4-6]。若对水飞蓟蛋白进行深入开发研究，必将显著提高水飞蓟加工的附加值。蛋白质可通过物理、化学和蛋白酶法对其进行改性。利用蛋白酶限制性的水解蛋白来提高蛋白质的功能特性，具有作用条件温和，不破坏氨基酸结构，产生有害物质的可能性小，安全性高等优点，而且通过酶解产生的小分子物质更易被人体消化吸收，因此利用酶法对蛋白质进行改性已经成为当今最重要的蛋白质改性技术。目前国内研究蛋白酶解改性主要集中在蛋白酶的选择与酶解工艺的优化，有少数研究是针对酶解程度对产物理化特性的影响[7-9]，但是酶解程度对水飞蓟蛋白理化特性的影响尚未见研究报道。因此，本研究拟通过中性蛋白酶酶解水飞蓟蛋白，考察不同酶解程度下水飞蓟蛋白的氨基酸组成及理化性质的变化，以期为水飞蓟蛋白的改性以及水飞蓟活性肽的开发与利用提供理论依据和数据支持。
1材料与方法
1.1材料和试剂
水飞蓟蛋白：自制；中性蛋白酶：无锡杰能科酶制剂公司；其他试剂均为分析纯。
1.2仪器与设备
ALPHAI-4/2-4 型冷冻干燥机：德国CHRIST公司；Agilent 1100液相色谱：美国安捷伦公司；WFJ7200 可见光分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司。
1.3方法
1.3.1水飞蓟蛋白的限制性酶解方法将水飞蓟蛋白配制成一定浓度的溶液，调节pH值和温度，加入适量的中性蛋白酶进行酶解。反应过程中不断加入0.5 mol/L NaOH溶液保持反应体系的pH值恒定。当达到预期水解度时，将反应液置于90 ℃保温灭酶，4 000 r/min离心20 min，上清液经浓缩后冷冻干燥即得蛋白酶解物。
1.3.2水飞蓟蛋白水解度的测定采用pH-stat法测水解度（DH）[10]。
1.3.3氨基酸组成的测定采用酸水解法。
1.3.4分子质量分布的测定采用高效液相色谱法。
1.3.5溶解性的测定采用考马斯亮蓝比色法。准确称取0.20 g样品溶于20 mL蒸馏水中，分别调节pH值至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室温搅拌30 min，然后4 000 r/min离心20 min，取1.0 mL上清液测定蛋白质含量。溶解度以上清液中蛋白质含量占体系中蛋白总量的百分比表示。
1.3.6持油性和乳化性的测定按参考文献[11]的方法进行。
2结果与分析
2.1酶解程度对水飞蓟蛋白氨基酸组成的影响
由表1可知，不同酶解程度的水飞蓟蛋白酶解物都富含谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和丝氨酸等氨基酸，随着酶解程度的提高，各氨基酸的含量都有所变化，其中一些抗氧化氨基酸（组氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸）的含量都较酶解前有所提高，其中甲硫氨酸的含量增加最显著，它们应该是酶解物具有抗氧化活性的重要物质基础，在一定程度上影响着不同酶解程度的酶解产物的抗氧化活性。
2.2酶解程度对水飞蓟蛋白相对分子质量的影响
由表2可知，随着酶解程度的增大，相对分子质量大于1 000 u的肽段的含量逐渐减少，小于1 000 u的肽段含量则逐渐增加。在180～1 000 u范围的组分含量由DH5%时的47.13%提高到了DH15%时的57.02%。大量研究证明：抗氧化肽多是分子质量<1 000 u的寡肽[12]，因此，通过比较不同酶解度酶解产物的相对分子质量分布，有助于解释其所具有的抗氧化活性的差异。
2.3酶解程度对水飞蓟蛋白溶解性的影响
水飞蓟蛋白及其水解物的溶解度见图1。从图1可见，水飞蓟蛋白具有典型的溶解度曲线，其在pH值5左右具有最低的溶解度。水解物呈现出与蛋白完全不一样的溶解度曲线，3种水解物在pH值5左右的低溶解性区域已消失，在所有测定的pH值范围内，水解物都具有较高的溶解性，不同水解度的水解物之间的溶解性也呈现出一定差异，随着水解度增大，各个pH值下的溶解性略有增高。
2.4酶解程度对水飞蓟蛋白持油性的影响
由图2可知，随着水解度的增大，酶解物的持油性逐渐降低。其中DH5%的水解物的持油性最好，比水飞蓟蛋白的持油性提高了33%左右，这可能是由于低度水解时，蛋白分子结构改变，分子中疏水基团暴露，使水解物的吸油性显著提高。但随着水解度的增大，多肽链被降解成更短的肽段，电荷的数量增加，极性增强，亲水基团增加，不利于形成蛋白质凝胶网络结构，导致吸油性降低[10]。 2.5酶解程度对水飞蓟蛋白乳化性及乳化稳定性的的影响
由图3可知，在有限水解范围内，中性蛋白酶水解产物比水飞蓟蛋白具有更好的乳化性，由于水解使蛋白质分子变小，构象发生了改变，一些包埋于蛋白质内部的疏水性残基暴露出来，利于其向水油界面扩散降低界面张力，同时水解后的肽分子更易定位于水油界面，所以酶解物的乳化活性较蛋白有一定的提高。由图4可知，水解物的乳化稳定性都高于水飞蓟蛋白，但随着水解度的增大酶解物的乳化稳定性逐渐降低，其中DH5%的水解物的乳化稳定性最高。可能是由于水解度的进一步提高，使更多极性基团暴露，包裹在油滴表面的肽段越来越小，使油滴表面的保护层越来越薄，最终导致了乳化稳定性的降低。
3结论
本研究比较了水解程度对水飞蓟蛋白氨基酸组成和理化性质的影响。研究发现水飞蓟蛋白经水解以后，各种氨基酸的含量都有所变化，特别是一些抗氧化氨基酸的含量都较酶解前有所提高；水解使水飞蓟蛋白的相对分子质量发生了变化，随着水解度的提高，相对分子质量较小的肽段逐渐增加；水解产物的溶解性显著提高；水解产物的乳化性和乳化稳定性都较水飞蓟蛋白有所提高，深度水解后的乳化稳定性有所下降。
参考文献：
[1]袁丹，张国峰，王瑞杰. 水飞蓟果实、果皮及其提取物质量评价法的研究[J]. 沈阳药科大学学报，2003，20（2）：119-122，131.
[2]陈毓荃，王春梅. 水飞蓟综合利用基础研究Ⅱ.果实油脂和蛋白质[J]. 西北农业学报，1998，7（1）：84-86.
[3]朱淑云，董英，陈晓东，等. 水飞蓟粕蛋白氨基酸组成及加工功能特性研究[J]. 中国粮油学报，2011，26（8）：71-74，83.
[4]Charrier C，Azerad R，Marhol P，et al. Preparation of silybin phase Ⅱ metabolites：Streptomyces catalyzed glucuronidation[J]. Journal of Molecular Catalysis B - Enzymatic，2014，102：167-173.
[5]Balszuweit F，John H，Schmidt A，et al. Silibinin as a potential therapeutic for sulfur mustard injuries[J]. Chemico-Biological Interactions，2013，206（3）：496-504.
[6]Sadava D，Kane Susan E. Silibinin reverses drug resistance in human small-cell lung carcinoma cells[J]. Cancer Letters，2013，339（1）：102-106.
[7]Zhao G L，Liu Y，Zhao M M，et al. Enzymatic hydrolysis and their effects on conformational and functional properties of peanut protein isolate[J]. Food Chemistry，2011，127（4）：1438-1443.
[8]刘远洋，顾炜，郭健，等. 酶解程度对花生蛋白理化性质及功能特性的影响[J]. 中国粮油学报，2012，27（2）：27-31.
[9]Wang J S，Su Y J，Jia F，et al. Characterization of casein hydrolysates derived from enzymatic hydrolysis[J]. Chemistry Central Journal，2013，7（1）：62.
[10]王素雅，刘胜，鞠兴荣，等. 中性蛋白酶限制性水解对高温菜籽粕蛋白功能性质的影响[J]. 食品与发酵工业，2010，36（1）：56-59.
[11]朱淑云，董英，肖香，等. 水飞蓟蛋白组分的理化特性研究[J]. 中国粮油学报，2013，28（10）：15-20.
[12]Zambrowicz A，Timmer M，Polanowski A，et al. Manufacturing of peptides exhibiting biological activity[J]. Amino Acids，2013，44（2）：315-320.谢宇奇，零学仕，周作树，等. 枫香树叶黑色素粗产品提取工艺的优化[J]. 江苏农业科学，2015，43（11：348-351.
关键词：水飞蓟蛋白；酶解程度；理化特性；氨基酸组成
中图分类号： TS201文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0346-02
收稿日期：2014-12-11
基金项目：江苏省镇江市农业科技支撑项目（编号：NY2012031）；江苏大学大学生科研立项资助项目（编号：13A109）；江苏大学大学生实践创新训练项目（编号：201410299169W）。
作者简介：朱淑云（1975—），女，山东青岛人， 博士，副教授，主要从事食品生物技术研究工作。E-mail：shyzhu@eyou.com。水飞蓟是一种传统的药用植物，其药用成分水飞蓟素主要存在于水飞蓟籽壳中，其籽仁中主要含有蛋白质、油脂和淀粉等物质[1]。研究发现，水飞蓟籽仁脱脂粉中蛋白质含量高达47.23%，水飞蓟蛋白以清蛋白为主，其氨基酸种类齐全，是一种优质的植物蛋白[2-3] 。然而目前国内外学者对水飞蓟的研究主要集中在对水飞蓟素的开发利用上，对水飞蓟蛋白的研究较少[4-6]。若对水飞蓟蛋白进行深入开发研究，必将显著提高水飞蓟加工的附加值。蛋白质可通过物理、化学和蛋白酶法对其进行改性。利用蛋白酶限制性的水解蛋白来提高蛋白质的功能特性，具有作用条件温和，不破坏氨基酸结构，产生有害物质的可能性小，安全性高等优点，而且通过酶解产生的小分子物质更易被人体消化吸收，因此利用酶法对蛋白质进行改性已经成为当今最重要的蛋白质改性技术。目前国内研究蛋白酶解改性主要集中在蛋白酶的选择与酶解工艺的优化，有少数研究是针对酶解程度对产物理化特性的影响[7-9]，但是酶解程度对水飞蓟蛋白理化特性的影响尚未见研究报道。因此，本研究拟通过中性蛋白酶酶解水飞蓟蛋白，考察不同酶解程度下水飞蓟蛋白的氨基酸组成及理化性质的变化，以期为水飞蓟蛋白的改性以及水飞蓟活性肽的开发与利用提供理论依据和数据支持。
1材料与方法
1.1材料和试剂
水飞蓟蛋白：自制；中性蛋白酶：无锡杰能科酶制剂公司；其他试剂均为分析纯。
1.2仪器与设备
ALPHAI-4/2-4 型冷冻干燥机：德国CHRIST公司；Agilent 1100液相色谱：美国安捷伦公司；WFJ7200 可见光分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司。
1.3方法
1.3.1水飞蓟蛋白的限制性酶解方法将水飞蓟蛋白配制成一定浓度的溶液，调节pH值和温度，加入适量的中性蛋白酶进行酶解。反应过程中不断加入0.5 mol/L NaOH溶液保持反应体系的pH值恒定。当达到预期水解度时，将反应液置于90 ℃保温灭酶，4 000 r/min离心20 min，上清液经浓缩后冷冻干燥即得蛋白酶解物。
1.3.2水飞蓟蛋白水解度的测定采用pH-stat法测水解度（DH）[10]。
1.3.3氨基酸组成的测定采用酸水解法。
1.3.4分子质量分布的测定采用高效液相色谱法。
1.3.5溶解性的测定采用考马斯亮蓝比色法。准确称取0.20 g样品溶于20 mL蒸馏水中，分别调节pH值至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室温搅拌30 min，然后4 000 r/min离心20 min，取1.0 mL上清液测定蛋白质含量。溶解度以上清液中蛋白质含量占体系中蛋白总量的百分比表示。
1.3.6持油性和乳化性的测定按参考文献[11]的方法进行。
2结果与分析
2.1酶解程度对水飞蓟蛋白氨基酸组成的影响
由表1可知，不同酶解程度的水飞蓟蛋白酶解物都富含谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和丝氨酸等氨基酸，随着酶解程度的提高，各氨基酸的含量都有所变化，其中一些抗氧化氨基酸（组氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸）的含量都较酶解前有所提高，其中甲硫氨酸的含量增加最显著，它们应该是酶解物具有抗氧化活性的重要物质基础，在一定程度上影响着不同酶解程度的酶解产物的抗氧化活性。
2.2酶解程度对水飞蓟蛋白相对分子质量的影响
由表2可知，随着酶解程度的增大，相对分子质量大于1 000 u的肽段的含量逐渐减少，小于1 000 u的肽段含量则逐渐增加。在180～1 000 u范围的组分含量由DH5%时的47.13%提高到了DH15%时的57.02%。大量研究证明：抗氧化肽多是分子质量<1 000 u的寡肽[12]，因此，通过比较不同酶解度酶解产物的相对分子质量分布，有助于解释其所具有的抗氧化活性的差异。
2.3酶解程度对水飞蓟蛋白溶解性的影响
水飞蓟蛋白及其水解物的溶解度见图1。从图1可见，水飞蓟蛋白具有典型的溶解度曲线，其在pH值5左右具有最低的溶解度。水解物呈现出与蛋白完全不一样的溶解度曲线，3种水解物在pH值5左右的低溶解性区域已消失，在所有测定的pH值范围内，水解物都具有较高的溶解性，不同水解度的水解物之间的溶解性也呈现出一定差异，随着水解度增大，各个pH值下的溶解性略有增高。
2.4酶解程度对水飞蓟蛋白持油性的影响
由图2可知，随着水解度的增大，酶解物的持油性逐渐降低。其中DH5%的水解物的持油性最好，比水飞蓟蛋白的持油性提高了33%左右，这可能是由于低度水解时，蛋白分子结构改变，分子中疏水基团暴露，使水解物的吸油性显著提高。但随着水解度的增大，多肽链被降解成更短的肽段，电荷的数量增加，极性增强，亲水基团增加，不利于形成蛋白质凝胶网络结构，导致吸油性降低[10]。 2.5酶解程度对水飞蓟蛋白乳化性及乳化稳定性的的影响
由图3可知，在有限水解范围内，中性蛋白酶水解产物比水飞蓟蛋白具有更好的乳化性，由于水解使蛋白质分子变小，构象发生了改变，一些包埋于蛋白质内部的疏水性残基暴露出来，利于其向水油界面扩散降低界面张力，同时水解后的肽分子更易定位于水油界面，所以酶解物的乳化活性较蛋白有一定的提高。由图4可知，水解物的乳化稳定性都高于水飞蓟蛋白，但随着水解度的增大酶解物的乳化稳定性逐渐降低，其中DH5%的水解物的乳化稳定性最高。可能是由于水解度的进一步提高，使更多极性基团暴露，包裹在油滴表面的肽段越来越小，使油滴表面的保护层越来越薄，最终导致了乳化稳定性的降低。
3结论
本研究比较了水解程度对水飞蓟蛋白氨基酸组成和理化性质的影响。研究发现水飞蓟蛋白经水解以后，各种氨基酸的含量都有所变化，特别是一些抗氧化氨基酸的含量都较酶解前有所提高；水解使水飞蓟蛋白的相对分子质量发生了变化，随着水解度的提高，相对分子质量较小的肽段逐渐增加；水解产物的溶解性显著提高；水解产物的乳化性和乳化稳定性都较水飞蓟蛋白有所提高，深度水解后的乳化稳定性有所下降。
参考文献：
[1]袁丹，张国峰，王瑞杰. 水飞蓟果实、果皮及其提取物质量评价法的研究[J]. 沈阳药科大学学报，2003，20（2）：119-122，131.
[2]陈毓荃，王春梅. 水飞蓟综合利用基础研究Ⅱ.果实油脂和蛋白质[J]. 西北农业学报，1998，7（1）：84-86.
[3]朱淑云，董英，陈晓东，等. 水飞蓟粕蛋白氨基酸组成及加工功能特性研究[J]. 中国粮油学报，2011，26（8）：71-74，83.
[4]Charrier C，Azerad R，Marhol P，et al. Preparation of silybin phase Ⅱ metabolites：Streptomyces catalyzed glucuronidation[J]. Journal of Molecular Catalysis B - Enzymatic，2014，102：167-173.
[5]Balszuweit F，John H，Schmidt A，et al. Silibinin as a potential therapeutic for sulfur mustard injuries[J]. Chemico-Biological Interactions，2013，206（3）：496-504.
[6]Sadava D，Kane Susan E. Silibinin reverses drug resistance in human small-cell lung carcinoma cells[J]. Cancer Letters，2013，339（1）：102-106.
[7]Zhao G L，Liu Y，Zhao M M，et al. Enzymatic hydrolysis and their effects on conformational and functional properties of peanut protein isolate[J]. Food Chemistry，2011，127（4）：1438-1443.
[8]刘远洋，顾炜，郭健，等. 酶解程度对花生蛋白理化性质及功能特性的影响[J]. 中国粮油学报，2012，27（2）：27-31.
[9]Wang J S，Su Y J，Jia F，et al. Characterization of casein hydrolysates derived from enzymatic hydrolysis[J]. Chemistry Central Journal，2013，7（1）：62.
[10]王素雅，刘胜，鞠兴荣，等. 中性蛋白酶限制性水解对高温菜籽粕蛋白功能性质的影响[J]. 食品与发酵工业，2010，36（1）：56-59.
[11]朱淑云，董英，肖香，等. 水飞蓟蛋白组分的理化特性研究[J]. 中国粮油学报，2013，28（10）：15-20.
[12]Zambrowicz A，Timmer M，Polanowski A，et al. Manufacturing of peptides exhibiting biological activity[J]. Amino Acids，2013，44（2）：315-320.谢宇奇，零学仕，周作树，等. 枫香树叶黑色素粗产品提取工艺的优化[J]. 江苏农业科学，2015，43（11：348-351.