第一次反共高潮结束以后，国民党将军事反共的重点南移，把反共目标指向敌后抗战的新四军，同时加紧在国民党统治区进行反共活动，两党关系更加紧张。1940年6月初，周恩来会见蒋介石，表明中共合作抗战诚意，谴责了国民党在抗战中“溶共”、“剿共”的反共行径。接着，周恩来又与何应钦、白崇禧就划分作战区域等一系列问题进行了多次谈判，但都无果而终。一场新的更大规模的反共高潮正在加紧酝酿。山雨欲来风满楼。在重庆的周恩来和中共中央南方局，即将面临第二次国共合作以来的最大危机和挑战。
　　“皓电”与“佳电”
　　1940年10月19日，国民政府军事委员会以参谋总长何应钦与副参谋总长白崇禧名义，签署致第十八集团军正、副总司令朱德、彭德怀和新四军军长叶挺的“皓电”，要求江南新四军“限于电到一个月内”，“全部开到”黄河以北指定地区。第二次反共高潮的序幕由此揭开。
　　为了探明国民党当局的政治动向，了解各界人士对时局变化的反应，给中共中央作出正确对策提供依据，周恩来、博古、叶剑英等南方局领导人频繁接触冯玉祥、孙科、覃振、于右任、章伯钧、沈钧儒、黄炎培、左舜生等各方面人士，征求他们对“皓电”和时局的看法。
　　10月24日，周恩来连续两次致电中共中央，提出“目前反共高潮正在着着上升”，提议不能同意“皓电”，但不能置之不理，军事上一要将新四军主力开至江北，便于集结应战;二要将主力立即分散，江北部队需作应战准备。为了使中共中央获得更充足的决策依据，11月1日，周恩来又两次致电中共中央，建议以朱、彭、叶、项名义通电答复“皓电”，表示皖南新四军在有充分保障条件下可移至江北。中共中央最终采纳了周恩来的建议。11月9日，由毛泽东起草的以朱、彭、叶、项名义致何、白的“佳电”，经叶剑英转给国民党当局。“佳电”刚柔并济地批驳了“皓电”中对八路军、新四军的诬蔑，既顾全大局，又坚持原则，发布后得到了国统区广大中间派的理解和同情，使中共在政治上取得了主动。
　　与此同时，为应对随时可能出现的危局，南方局除要求《新华日报》将“佳电”广泛印送给各阶层人士外，还加强国际统一战线工作力度，特意向英、美、苏、法等驻华使团及在华国际团体提供了整理的国共关系资料。12月下旬，周恩来约见美国著名作家安娜·路易斯·斯特朗，向她说明国共两党分歧的实质及发生重大反共事件的危险性。周恩来向其说明：我们不想过早地暴露这些冲突以加剧摩擦，不过我们愿意把这些材料交到值得信任的外国人士手中，以便在蒋介石展开更加疯狂的进攻时予以揭露。
　　12月25日，蒋介石约见周恩来，称新四军都是他的部下，只要“说出一条北上的路，我可担保绝对不会妨碍你们通过”。但“如果你们非留在江北免调不可”，“冲突绝难避免”。次日，周恩来给中共中央发电指出：蒋的承诺“靠不住”，这次不过是“吓压之余，又加上哄之一着”罢了，而事实上，国民党“局部‘剿共’仍在加紧布置中”。
　　坚守与反攻
　　1941年1月6日，奉命北移的新四军军部和直属部队9000余人，行至安徽省泾县茂林地区，突遭国民党军8万余人包围袭击，“皖南事变”发生。大部分将士英勇牺牲，军长叶挺被扣，副军长项英等遇害。1月7日，周恩来得到皖南新四军遭袭消息，当即向国民党联络代表张冲提出强烈抗议。1月11日，周恩来在参加《新华日报》创刊3周年庆祝晚会时，再一次收到有关事变的急电，他当即向与会各界人士宣布电文，强烈谴责了国民党顽固派的罪行。他指出：“黑暗只是暂时的，光明一定会到来。” 1月17日，周恩来在获悉蒋介石宣布取消新四军番号后，即在曾家岩50号给何应钦打电话，义正词严地指出：“你们的行为使亲者痛，仇者快。你们做了日寇想做而做不到的事。你何应钦是中华民族的千古罪人。”是日晚，周恩来在红岩办事处二楼走道召集南方局、八路军驻重庆办事处人员开会，通报事变发生经过。他指出：目前时局发展有两种可能，一是国共完全决裂;二是国民党不敢全面反共，经过斗争两党还可继续合作抗日。而我们则应从最坏的可能准备，争取最好的结果。次日凌晨，周恩来奋笔写下“为江南死国难者志哀”和“千古奇冤，江南一叶，同室操戈，相煎何急！？”的题词与挽诗。《新华日报》连夜刊印，在天亮前发往全城，使事变真相大白于天下。
　　时局骤变后，中共中央基于对南方局领导人和国统区党组织安全上的考虑，在1941年1月18日至2月1日的十多天時间内，连续数次发电，紧急指示周恩来、叶剑英、董必武等人撤回延安，并将其他党内外人员转移到安全地区。中共中央的指示非常迫切，仅在1月25日一天内即两次来电要周恩来等“迅即回延”。南方局收到中共中央指示后，召开紧急会议分析形势。周恩来认为，国共关系尚未到最后决裂之时，断然决定要坚持到最后，争取时局好转。与会人员亦表示要留下坚持战斗。南方局反复向中共中央陈述理由，最终得到中共中央同意。1月27日，重庆八办全体工作人员给中共中央和毛泽东、朱德发出电报说：“处在政治环境极端严重的重庆办事处同志向你们保证：无论在任何恶劣的情况下，我们仍以不屈不挠的精神，坚守我们的岗位，为党的任务奋斗到最后一口气。”两天后，重庆八办收到毛泽东、朱德的回电：“甚慰，望努力奋斗，光明就在前面，黑暗总会灭亡。全国全世界人民都是援助我们的。”
　　这期间，周恩来和南方局其他领导人一起，一方面及时给国民党顽固派以有力反击，另一方面又细致周密地进行了南方局、重庆八办和《新华日报》馆的干部转移和撤退工作。在周恩来的直接关怀下，滞留于重庆、桂林等地的进步文化界人士也进行了转移和疏散。2月1日，遵照中共中央指示，叶剑英率领蒋南翔、李涛、边章五等飞返延安，并向中共中央汇报南方局在重庆坚持斗争的情形。毛泽东听后给周恩来去电，对南方局工作表达了“欣慰之至”的高度赞许。随即，中共中央决定对第二次反共高潮采取“政治上取全面攻势，军事上取守势”的方针，并指示南方局“坚决反攻，跟踪追击，绝不游移，绝不妥协”，开始对国民党顽固派发动猛烈的政治攻势。 　　击退反共高潮
　　1941年1月19日，南方局印制了《新四军皖南部队惨被围歼真相》传单，并广为散发。1月20日，中共中央军委发布重建新四军军部命令。同日，毛泽东以中共中央革命军事委员会发言人的名义发表谈话，揭露国民党顽固派的反共阴谋。周恩来通过国民党联络代表张冲，及时将上述“命令”和“谈话”转交国民党中央。随即，宋庆龄、柳亚子、何香凝、陈友仁等在香港发出抗议，并致函蒋介石。国统区中间党派也愤然抗议，章伯钧等与周恩来会面，表示准备成立民主联合会，团结各中间党派、无党派人士，与中共加强合作，共同推进民主改革和反对内战的意愿。
　　国民党内也不乏反对内战者，张治中向蒋介石呈万言书，痛陈国民党当局对中共问题处理失策，认为皖南事变是招致两党破裂的开始，关系至大。国民参政会秘书长王世杰当面向蒋介石请求慎重处置新四军问题，以免造成内战危险及国际间的不良观感。国共谈判联络代表张冲，在事变发生后“感到没脸见人”。他对周恩来说：一朝中总有秦桧、岳飞，我们是忠，他们（指亲日派）是奸。不仅如此，在第一次反共高潮中曾充当过急先锋的阎锡山，此时也对当局表示失望，认为重庆政府中有一部分不受欢迎的人，他们直接危害抗战，间接帮助日本。时任国民党军委会副委员长的冯玉祥，在军委会政治部第二次国际问题座谈会所作的演讲中，以波兰与法国不和而导致亡国的教训，呼吁国共两党珍视民族团结，且对国民党顽固派制造分裂提出警告。针对顽固派挑起反共分裂活动的事实，冯玉祥曾大骂何应钦搞阴谋，且对蒋介石表达了愤慨。综上可以说明，国民党内不少人主张国共合作抗战，破坏抗战的只是一股逆流。
　　与此同时，经过南方局外事组的工作，美、英、苏等驻华使馆以及国际机构也了解了事变真相，逐渐对中共倾于同情和支持。苏联驻华大使潘友新指出：中国内战意味着灭亡。1941年1月下旬，英国驻华大使卡尔与周恩来会晤后，将事件真相报告本国政府，英国政府即电告蒋介石，指出内战只会加强日军的攻击。2月中旬，美国总统特使居里与周恩来秘密会见不久后，便向蒋介石声明：“美国政府在国共纠纷未解决前，无法大量援华。”一时间，国民党当局在政治上陷于空前孤立的境地。
　　1941年2月初，第二届国民参政会召开在即。为抗议国民党制造的系列反共事件，中共参政员拒绝出席这次会议。是月10日，周恩来约见黄炎培、沈钧儒、章伯钧、张申府、左舜生等民主人士，告知中共拒绝出席参政会的理由，并获得他们谅解。3月2日，中共参政员董必武、邓颖超致函国民参政会，提出承认中共和中間党派以及陕甘宁边区合法地位、释放皖南事变被捕人员等十二条作为出席会议条件。中共的坚决态度，赢得中间势力的拥护和支持，最终迫使蒋介石在第二届国民参政会上作出“以后决无剿共之军事”的承诺。3月8日，国民参政会仍选举董必武为驻会参政员。3月14日，蒋介石约请周恩来面谈，询问中共中央有何意见，做出缓和两党关系的姿态，表现出部分让步和谋求妥协之意。至此，在中共中央领导下，周恩来等南方局领导人经过与国民党顽固派的反复较量，达到了以斗争求团结，维系合作抗战大局的目的。
　　国民党顽固派发动的第二次反共高潮，以军事反共开始，虽然新四军受到严重损失，但这一反共行径却使国民党顽固派在政治上陷入被动，在道义上失去人心，使中间势力抛弃了对他们的幻想，进一步拉近了中间势力与中共的合作关系。从此，在中国政治舞台上，国民党的地位日益下降，中国共产党的地位日益上升。