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摘要 [目的]探讨庆大霉素废水对斑马鱼的急性毒性效应。[方法]采用静水式直接接触致毒法，研究庆大霉素废水对斑马鱼的急性毒性效应。根据斑马鱼在各时间段的死亡率求出半致死浓度（LC50），根据LC50判断庆大霉素废水的毒性等级。[结果]预试验结果表明，斑马鱼暴露于庆大霉素体积百分比为30%的废水中24 h 100 %死亡（24 h LC100）和体积百分比为10%的废水96 h 零死亡（96 h LC0）。急性毒性试验结果表明，在（22±1） ℃下，庆大霉素废水4、8、12、24、48、72、96 h的LC50分别为23.975%、21.210%、19.050%、18.395%、16.779%、16.779%、16.779%。庆大霉素废水不同时段的LC50为10%～50%，Tua值为2～10，毒性等级为中等毒性。[结论]研究结果可以为庆大霉素废水对水生生物的亚急性毒性研究提供相关数据。
关键词 环境毒理学；庆大霉素废水；斑马鱼；急性毒性；半致死浓度
Acute Toxic Effects of Gentamicin Wastewater on Zebrafish
MENG Jing-wen1，2，XIE Wei-fang1，2，DONG Yu-xin1，2，SHEN Hong-yan1，2* （1.School of Environmental Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，Hebei 050018；2.Medical Molecular Chemistry Laboratory of Hebei Province，Shijiazhuang，Hebei 050018）
Abstract [Objective]To discuss the acute toxic effects of gentamicin wastewater on zebrafish.[Method]The acute toxicity effects of gentamicin wastewater to zebrafish were determined by using hydrostatic contact test methods.The median lethal concentration （LC50） was caculated according to the mortality of zebrafish in each period，and gentamicin wastewater′s toxicity grade was judged according to LC50.[Result] The pre-test showed that 24 h LC100 and 96 h LC0 for zebrafish exposing to gentamicin wastewater were 30% and 10% respectively.The acute toxicity test indicated that 4，8，12，24，48，72，96 h LC50 for zebrafish at （22±1）℃ were 23.975%，21.210%，19.050%，18.395%，16.779%，16.779%，16.779% respectively.The research showed that LC50 values were 10%-50%， Tua values were between 2 and 10， the toxicity grade was moderate toxicity.[Conclusion]The research results can provide some data for studying the subacute toxicity of gentamicin wastewater to aquatic organisms.
Key words Environmental toxicology；Gentamicin wastewater；Zebrafish；Acute toxicity；LC50
抗生素廢水不仅是pH变化趋势大、色度很高、气味比较刺鼻，而且是含有残留抗生素等难降解有机物以及高浓度生物毒性物质的一种有机废水。近年来，国内外报道了很多抗生素对藻类、蚤类、发光菌、鱼类的急性毒性试验[1-5]。孟文娜等[6]研究了土霉素对日本锦鲫肝脏抗氧化防御系统的影响，但关于抗生素废水对斑马鱼的致毒效应研究较少，尤其是庆大霉素废水。鱼类对于水环境的变化反应是尤为灵敏的，当水体污染达到一定浓度时，鱼类就会产生一系列中毒反应，如出现行为异常、生理功能紊乱，直至死亡[7]。鱼类急性毒性试验不仅用于测定化学物质毒性强度和水体污染程度，检测废水处理效果，而且也为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供了重要技术支撑。斑马鱼（Zebrafish）在常规毒性试验、分子及细胞生态毒理、生物致突变效应检测和环境激素测试等生态毒理领域中已被广泛应用[8]。在急性毒性试验中，通常采用半致死浓度（LC50）来表示受试物的急性毒性大小。笔者以斑马鱼为受试生物，以庆大霉素废水为受试毒物，将斑马鱼暴露于庆大霉素废水中，测定其在恒定状态下4、8、12、24、48、72、96 h的LC50值，观察庆大霉素废水对水生生物的急性毒性效应，旨在为其后续的亚急性毒性研究提供相关数据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验生物。
受试生物斑马鱼（Zebrafish）购于石家庄市某花鸟鱼虫市场，体长为（25±3） mm，体质量（0.20±0.05） g，试验前在实验室环境下驯养7 d，自然死亡率不得超过5%，试验前48 h以及在整个急性毒性试验期间（96 h），不对斑马鱼进行喂食。 1.1.2 仪器与耗材。曝气泵；温度计；量筒；酸度计（FE20）；溶解氧测定仪（JPBJ-608）；水质硬度计（YD300）；5 L玻璃鱼缸等。
1.1.3 试验水样。
庆大霉素废水来自某制药企业污水处理厂进水（生产过程中的排放水）。水样保存在0～4 ℃的冰柜中备用，4 h与96 h水质发生了物理变化。前者水样呈深灰色，刺激性气味，有大量的深灰色絮状物；后者水样呈浅灰色，气味仍然刺鼻，絮状物明显减少（图1）。试验前对水样的COD、TOC、TN、pH等常规性指标进行了测定，结果见表1。
1.2 试验方法
1.2.1 試验设计。
（1）预试验。在5 L玻璃水族缸中盛放4 L 试液，设置5个试验暴露组，体积分数分别为10.00%、30.00%、50.00%、70.00%和90.00%，不设平行，每24 h 更换试液1次，每个暴露组放入5 尾斑马鱼，试验连续进行96 h，筛选出24 h 100%死亡浓度（24 h LC100）和96 h零死亡浓度（96 h LC0） 。
（2）急性毒性试验。根据预试验得出的结果，按等对数间距设置5个试验暴露组。试验设置2个平行组，同时设置1个空白试验组，试验最后得出鱼类96 h半致死浓度（96 h LC50）。每个暴露组随机放入12尾斑马鱼，试验周期为96 h。
每天检测试验溶液的pH、溶解氧（DO）和温度，pH维持在7.4～7.6，DO值为5 mg/L，温度控制在（22±1） ℃，试验期间需连续曝气，试验方式为静水式（每24 h更换试液1次[9]）。试验时间为96 h，分别在4、8、12、24、48、72、96 h观察斑马鱼的死亡数，确定半致死浓度。
急性毒性试验中的斑马鱼质量控制符合《水和废水监测分析方法》中鱼类毒性试验方法的要求，即对照组死亡率不得高于10%，试验用鱼在与试验相同的环境条件下提前驯养14 d[10]。试验期间，空白对照组试验斑马鱼均表现正常，并未出现死亡或中毒反应，水质监测结果表明试验溶液的溶解氧含量均在5 mg/L 以上。
1.2.2 数据统计与分析。
半致死浓度（LC50）：根据概率单位加权回归（Bliss） 法，又称图解法，包括求剂量反应曲线方程和半致死浓度的95%置信区间[11]。
（1）求剂量反应直线方程。以试验浓度对数值x为横轴，以死亡概率单位y 为纵轴，绘制散点图，得到回归曲线。从回归曲线上死亡概率单位为5的点作垂线与横轴相交，读数即为lgLC50，取lgLC50的反对数即可得到LC50值。
（2）半致死浓度的95%置信区间。通常以总体LC50的 95%置信区间，为可接受的LC50范围。
①标准误差的计算：SlgLC50 =S（N’/2） 。式中，回归曲线的斜率倒数用S表示；死亡概率单位4～6范围内各组试验动物数之和用N’表示。②总体LC50的 95%置信区间的对数值（lgLC50-1.96SlgLC50，lgLC50+1.96SlgLC50）对上述结果取反对数，即得到总体 LC50的95%置信区间。
2 结果与分析
2.1 预试验结果
庆大霉素废水对斑马鱼的预试验持续96 h，得出24 h 100%死亡浓度 （24 h LC100） 为30%，96 h无死亡浓度（96 h LC0）为10%。
2.2 急性毒性试验结果
当斑马鱼处于庆大霉素废水中时，10%、13%浓度组的斑马鱼在染毒后有轻微的中毒症状：浮于水面游动缓慢、倒游、竖立于水中[12]，约10 h后行动恢复正常，但24 h 后出现死亡；16.90%、21.90%、28.56%浓度组的斑马鱼在染毒1 h后中毒症状明显，呼吸加剧、失衡、活力减弱，鱼体侧卧，轻触鱼背，抽搐、向上跳跃最后出现麻痹甚至死亡状态[13]。空白对照组中斑马鱼均表现正常，出现零中毒和零死亡现象。
2.3 不同体积分数的庆大霉素废水对斑马鱼的急性毒性效应
随着庆大霉素废水体积分数的增加，对斑马鱼呈现的急性毒性效应也逐渐增强（表2），表现为斑马鱼死亡率明显升高，当庆大霉数废水体积分数达28.56%时，24 h内受试斑马鱼累积死亡率达100%。这与武晨虹[14]在研究青霉素废水对斑马鱼的急性毒性效应时也得出随着青霉素废水浓度的增加，斑马鱼的死亡数目增多，死亡率也随之增大的结论相一致。从图2可以看出，在不同体积分数的庆大霉素废水中斑马鱼死亡率与试验浓度对数值存在明显的剂量-效应关系[15]，随着暴露浓度的增加，斑马鱼的死亡率显著上升。在整个试验中，庆大霉素废水对斑马鱼的暴露浓度对数值-死亡率曲线均呈不规则的 S 形[16]，即斑马鱼死亡率随着暴露浓度的升高而升高，但最初急速升高，后来缓慢上升。
2.4 庆大霉素废水对斑马鱼的急性毒性效应参数分析
依据斑马鱼在4、8、12、24、48、72、96 h的死亡率，通过建立死亡概率单位（y）与试验浓度对数值（x）的回归方程，各时段均显示出较强的正相关性（R2>0.810），计算出LC50、Tua值和95%置信区间。
由表3可知，随着暴露时间的延长，LC50呈现下降趋势，庆大霉素废水的毒性逐渐增强。在整个试验周期内，试验时间越长，LC50值越小，庆大霉素废水的毒性越大，即废水对斑马鱼的毒性大小受试验时间的影响[17]。24 h后，随试验时间的延长，LC50值下降缓慢，表明随着试验时间的延长，废水致毒能力缓慢增长。48～96 h内LC50均为16.779%，表明在这个时段内庆大霉素废水对斑马鱼的毒性不再增强。胡青云等[18]在研究染发废水对鲤鱼的急性毒性试验中发现，试验鱼致死时间主要集中在24 h内，24～48 h内死亡率缓慢增长，48～96 h死亡率不再变化。 2.5 庆大霉素废水的毒性等级
根据工业废水毒性等级划分标准[20-22]，庆大霉素废水在96 h内各观察时间段的LC50均介于10%～50%，Tua值也均在2～10（表4），属于中毒废水。
3 结论
（1）预试验结果表明，庆大霉素废水在96 h周期试验中，24 h LC100和 96 h LC0试液中废水浓度分别为30%和10%；急性毒性试验结果表明，96 h LC50为16.779%，庆大霉素废水在96 h内各观察时间段的LC50均介于10%～50%，Tua值为2～10，属于中毒性废水。
（2）回归曲线表明，斑马鱼死亡率与庆大霉素废水浓度和暴露时间（试验时间）成正比。庆大霉素废水浓度越大、暴露时间越长，斑马鱼的死亡数量越多，死亡率也随之增大，毒性越大。
参考文献
[1] 毕田田，赵海燕，张双灵.氧氟沙星乳酸诺氟沙星和恩诺沙星对金鱼的急性毒性试验研究[J].农产品加工，2015（8）：31-33，37.
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关键词 环境毒理学；庆大霉素废水；斑马鱼；急性毒性；半致死浓度
Acute Toxic Effects of Gentamicin Wastewater on Zebrafish
MENG Jing-wen1，2，XIE Wei-fang1，2，DONG Yu-xin1，2，SHEN Hong-yan1，2* （1.School of Environmental Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，Hebei 050018；2.Medical Molecular Chemistry Laboratory of Hebei Province，Shijiazhuang，Hebei 050018）
Abstract [Objective]To discuss the acute toxic effects of gentamicin wastewater on zebrafish.[Method]The acute toxicity effects of gentamicin wastewater to zebrafish were determined by using hydrostatic contact test methods.The median lethal concentration （LC50） was caculated according to the mortality of zebrafish in each period，and gentamicin wastewater′s toxicity grade was judged according to LC50.[Result] The pre-test showed that 24 h LC100 and 96 h LC0 for zebrafish exposing to gentamicin wastewater were 30% and 10% respectively.The acute toxicity test indicated that 4，8，12，24，48，72，96 h LC50 for zebrafish at （22±1）℃ were 23.975%，21.210%，19.050%，18.395%，16.779%，16.779%，16.779% respectively.The research showed that LC50 values were 10%-50%， Tua values were between 2 and 10， the toxicity grade was moderate toxicity.[Conclusion]The research results can provide some data for studying the subacute toxicity of gentamicin wastewater to aquatic organisms.
Key words Environmental toxicology；Gentamicin wastewater；Zebrafish；Acute toxicity；LC50
抗生素廢水不仅是pH变化趋势大、色度很高、气味比较刺鼻，而且是含有残留抗生素等难降解有机物以及高浓度生物毒性物质的一种有机废水。近年来，国内外报道了很多抗生素对藻类、蚤类、发光菌、鱼类的急性毒性试验[1-5]。孟文娜等[6]研究了土霉素对日本锦鲫肝脏抗氧化防御系统的影响，但关于抗生素废水对斑马鱼的致毒效应研究较少，尤其是庆大霉素废水。鱼类对于水环境的变化反应是尤为灵敏的，当水体污染达到一定浓度时，鱼类就会产生一系列中毒反应，如出现行为异常、生理功能紊乱，直至死亡[7]。鱼类急性毒性试验不仅用于测定化学物质毒性强度和水体污染程度，检测废水处理效果，而且也为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供了重要技术支撑。斑马鱼（Zebrafish）在常规毒性试验、分子及细胞生态毒理、生物致突变效应检测和环境激素测试等生态毒理领域中已被广泛应用[8]。在急性毒性试验中，通常采用半致死浓度（LC50）来表示受试物的急性毒性大小。笔者以斑马鱼为受试生物，以庆大霉素废水为受试毒物，将斑马鱼暴露于庆大霉素废水中，测定其在恒定状态下4、8、12、24、48、72、96 h的LC50值，观察庆大霉素废水对水生生物的急性毒性效应，旨在为其后续的亚急性毒性研究提供相关数据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验生物。
受试生物斑马鱼（Zebrafish）购于石家庄市某花鸟鱼虫市场，体长为（25±3） mm，体质量（0.20±0.05） g，试验前在实验室环境下驯养7 d，自然死亡率不得超过5%，试验前48 h以及在整个急性毒性试验期间（96 h），不对斑马鱼进行喂食。 1.1.2 仪器与耗材。曝气泵；温度计；量筒；酸度计（FE20）；溶解氧测定仪（JPBJ-608）；水质硬度计（YD300）；5 L玻璃鱼缸等。
1.1.3 试验水样。
庆大霉素废水来自某制药企业污水处理厂进水（生产过程中的排放水）。水样保存在0～4 ℃的冰柜中备用，4 h与96 h水质发生了物理变化。前者水样呈深灰色，刺激性气味，有大量的深灰色絮状物；后者水样呈浅灰色，气味仍然刺鼻，絮状物明显减少（图1）。试验前对水样的COD、TOC、TN、pH等常规性指标进行了测定，结果见表1。
1.2 试验方法
1.2.1 試验设计。
（1）预试验。在5 L玻璃水族缸中盛放4 L 试液，设置5个试验暴露组，体积分数分别为10.00%、30.00%、50.00%、70.00%和90.00%，不设平行，每24 h 更换试液1次，每个暴露组放入5 尾斑马鱼，试验连续进行96 h，筛选出24 h 100%死亡浓度（24 h LC100）和96 h零死亡浓度（96 h LC0） 。
（2）急性毒性试验。根据预试验得出的结果，按等对数间距设置5个试验暴露组。试验设置2个平行组，同时设置1个空白试验组，试验最后得出鱼类96 h半致死浓度（96 h LC50）。每个暴露组随机放入12尾斑马鱼，试验周期为96 h。
每天检测试验溶液的pH、溶解氧（DO）和温度，pH维持在7.4～7.6，DO值为5 mg/L，温度控制在（22±1） ℃，试验期间需连续曝气，试验方式为静水式（每24 h更换试液1次[9]）。试验时间为96 h，分别在4、8、12、24、48、72、96 h观察斑马鱼的死亡数，确定半致死浓度。
急性毒性试验中的斑马鱼质量控制符合《水和废水监测分析方法》中鱼类毒性试验方法的要求，即对照组死亡率不得高于10%，试验用鱼在与试验相同的环境条件下提前驯养14 d[10]。试验期间，空白对照组试验斑马鱼均表现正常，并未出现死亡或中毒反应，水质监测结果表明试验溶液的溶解氧含量均在5 mg/L 以上。
1.2.2 数据统计与分析。
半致死浓度（LC50）：根据概率单位加权回归（Bliss） 法，又称图解法，包括求剂量反应曲线方程和半致死浓度的95%置信区间[11]。
（1）求剂量反应直线方程。以试验浓度对数值x为横轴，以死亡概率单位y 为纵轴，绘制散点图，得到回归曲线。从回归曲线上死亡概率单位为5的点作垂线与横轴相交，读数即为lgLC50，取lgLC50的反对数即可得到LC50值。
（2）半致死浓度的95%置信区间。通常以总体LC50的 95%置信区间，为可接受的LC50范围。
①标准误差的计算：SlgLC50 =S（N’/2） 。式中，回归曲线的斜率倒数用S表示；死亡概率单位4～6范围内各组试验动物数之和用N’表示。②总体LC50的 95%置信区间的对数值（lgLC50-1.96SlgLC50，lgLC50+1.96SlgLC50）对上述结果取反对数，即得到总体 LC50的95%置信区间。
2 结果与分析
2.1 预试验结果
庆大霉素废水对斑马鱼的预试验持续96 h，得出24 h 100%死亡浓度 （24 h LC100） 为30%，96 h无死亡浓度（96 h LC0）为10%。
2.2 急性毒性试验结果
当斑马鱼处于庆大霉素废水中时，10%、13%浓度组的斑马鱼在染毒后有轻微的中毒症状：浮于水面游动缓慢、倒游、竖立于水中[12]，约10 h后行动恢复正常，但24 h 后出现死亡；16.90%、21.90%、28.56%浓度组的斑马鱼在染毒1 h后中毒症状明显，呼吸加剧、失衡、活力减弱，鱼体侧卧，轻触鱼背，抽搐、向上跳跃最后出现麻痹甚至死亡状态[13]。空白对照组中斑马鱼均表现正常，出现零中毒和零死亡现象。
2.3 不同体积分数的庆大霉素废水对斑马鱼的急性毒性效应
随着庆大霉素废水体积分数的增加，对斑马鱼呈现的急性毒性效应也逐渐增强（表2），表现为斑马鱼死亡率明显升高，当庆大霉数废水体积分数达28.56%时，24 h内受试斑马鱼累积死亡率达100%。这与武晨虹[14]在研究青霉素废水对斑马鱼的急性毒性效应时也得出随着青霉素废水浓度的增加，斑马鱼的死亡数目增多，死亡率也随之增大的结论相一致。从图2可以看出，在不同体积分数的庆大霉素废水中斑马鱼死亡率与试验浓度对数值存在明显的剂量-效应关系[15]，随着暴露浓度的增加，斑马鱼的死亡率显著上升。在整个试验中，庆大霉素废水对斑马鱼的暴露浓度对数值-死亡率曲线均呈不规则的 S 形[16]，即斑马鱼死亡率随着暴露浓度的升高而升高，但最初急速升高，后来缓慢上升。
2.4 庆大霉素废水对斑马鱼的急性毒性效应参数分析
依据斑马鱼在4、8、12、24、48、72、96 h的死亡率，通过建立死亡概率单位（y）与试验浓度对数值（x）的回归方程，各时段均显示出较强的正相关性（R2>0.810），计算出LC50、Tua值和95%置信区间。
由表3可知，随着暴露时间的延长，LC50呈现下降趋势，庆大霉素废水的毒性逐渐增强。在整个试验周期内，试验时间越长，LC50值越小，庆大霉素废水的毒性越大，即废水对斑马鱼的毒性大小受试验时间的影响[17]。24 h后，随试验时间的延长，LC50值下降缓慢，表明随着试验时间的延长，废水致毒能力缓慢增长。48～96 h内LC50均为16.779%，表明在这个时段内庆大霉素废水对斑马鱼的毒性不再增强。胡青云等[18]在研究染发废水对鲤鱼的急性毒性试验中发现，试验鱼致死时间主要集中在24 h内，24～48 h内死亡率缓慢增长，48～96 h死亡率不再变化。 2.5 庆大霉素废水的毒性等级
根据工业废水毒性等级划分标准[20-22]，庆大霉素废水在96 h内各观察时间段的LC50均介于10%～50%，Tua值也均在2～10（表4），属于中毒废水。
3 结论
（1）预试验结果表明，庆大霉素废水在96 h周期试验中，24 h LC100和 96 h LC0试液中废水浓度分别为30%和10%；急性毒性试验结果表明，96 h LC50为16.779%，庆大霉素废水在96 h内各观察时间段的LC50均介于10%～50%，Tua值为2～10，属于中毒性废水。
（2）回归曲线表明，斑马鱼死亡率与庆大霉素废水浓度和暴露时间（试验时间）成正比。庆大霉素废水浓度越大、暴露时间越长，斑马鱼的死亡数量越多，死亡率也随之增大，毒性越大。
参考文献
[1] 毕田田，赵海燕，张双灵.氧氟沙星乳酸诺氟沙星和恩诺沙星对金鱼的急性毒性试验研究[J].农产品加工，2015（8）：31-33，37.
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