【摘 要】
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目的构建能够同时表达人免疫调节因子IL-12,GM-CSF和B7.1的新型抗肿瘤免疫基因治疗剂pVAX-IL-12-GB,验证以上免疫调节因子基因在293T细胞的表达以及IL-12基因在活体内的表达
【机 构】
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中国人民解放军总医院泌尿外科,军事医学科学院基础医学研究所
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目的构建能够同时表达人免疫调节因子IL-12,GM-CSF和B7.1的新型抗肿瘤免疫基因治疗剂pVAX-IL-12-GB,验证以上免疫调节因子基因在293T细胞的表达以及IL-12基因在活体内的表达。方法将人IL-12基因克隆到早期构建好的pVAX-IRES-GM-CSF-B7.1真核表达质粒的上游,将其构建成为pVAX-IL-12-GB重组质粒;利用脂质体法瞬时转染293T细胞,RT-PCR检测IL-12和GM-CSF-B7.1基因的转录,ELISA法检测细胞上清中上游IL-12基因和下游GM-CSF基因的蛋白表达,流式细胞术及免疫荧光检测下游B7.1基因的表达;利用电穿孔方法递送质粒进入小鼠股四头肌,免疫组化法检测IL-12基因在小鼠活体内的表达情况。结果双酶切以及PCR鉴定获得的片段均与预期的片段大小一致,测序分析证实IL-12基因序列完全正确;瞬时转染293T细胞后,分别验证了人IL-12,GM-CSF和B7.1基因的mRNA转录和蛋白表达;电穿孔递送质粒后,活体肌肉组织内同样可以检测到IL-12基因的表达。结论成功构建了可以同时表达人IL-12,GM-CSF和B7.1的新型抗肿瘤免疫基因治疗剂,为下一步开展肿瘤免疫基因治疗研究奠定了坚实的基础。
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