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摘 要：从理想药物载体的设计角度出发，通过引入功能性单体，采用迈克尔加成聚合法以及材料表面改性的方法构建还原降解、肿瘤靶向的智能型聚合物纳米载体。首先，以N，N′-双（丙烯酰）胱胺和1-（2-胺乙基）哌嗪为单体聚合得到可还原降解的超支化聚酰胺胺（DHPAA）。在此基础上，通过接枝聚乙二醇和偶联叶酸得到稳定的、肿瘤靶向的智能型超支化聚酰胺胺（FA-DHPAP）。使用红外光谱、核磁共振、动态光散射（DLS）、Zeta电位仪、拉曼光谱和凝胶渗透色谱（GPC）对聚合物DHPAA结构和性能进行表征；使用核磁共振、动态光散射（DLS）、Zeta电位仪和透射电镜（TEM）对聚合物FA-DHPAP的结构和性能进行表征。通过细胞毒性实验对聚合物DHPAA和FA-DHPAP的生物相容性进行表征。结果表明：该智能型超支化聚酰胺胺（FA-DHPAP）能够响应环境、具有良好的生物相容性，因此作为药物载体在肿瘤治疗中具有较好的应用前景。
关键词：超支化聚酰胺胺；还原降解；肿瘤靶向；药物载体
文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2016）07-0053-06
Abstract： Starting from the design of an ideal drug carrier， smart redox-degradable and tumor-targeted polymeric nanocarrier was fabricated by introducing functional monomers and using Michael addition polymerization and material surface modification. Firstly， redox-degradable hyperbranched polyamidoamine（DHPAA） was prepared by Michael addition polymerization taking N，N′-bis（acryloyl） cystamine and 1-（2-aminoethyl） piperazine as functional monomer. On this basis， graft copolymerization of polyethylene glycol and conjugation of folic acid were conducted on DHPAA to obtain stable and tumor-targeted smart hyperbranched polyamidoamine（FA-DHPAP）. The structure and performance of polymer DHPAA were characterized by FTIR， NMR， DLS， Zeta potentiometer， Raman spectrometer and GPC. The structure and performance of polymer FA-DHPAP were characterized by NMR， DLS， Zeta potentiometer and TEM. The biocompatibility of the polymer DHPAA and FA-DHPAP as drug carrier was further confirmed by cytotoxicity test. The results showed that the smart hyperbranched polyamidoamine（FA-DHPAP） is environment-responsive and has good biocompatibility， thus it has great potential to be used as drug carrier for the tumor therapy.
Keywords： hyperbranched polyamidoamine； redox-degradable； tumor-targeted； drug vehicle
0 引 言
肿瘤是威胁人类健康与生命的疾病之一，化疗仍是目前治疗肿瘤疾病的主要手段之一。随着材料科学与医学的发展，聚合物材料被广泛用于药物载体[1]。超支化聚酰胺胺由于制备简单、易分离提纯，内部具有空腔、表面具有大面末端氨基等特点，可用于包裹或者连接药物等活性分子，因此在药物传递和基因转染等生物医药领域得到了广泛研究[2-3]。然而，聚酰胺胺表面带有的大量正电荷易与带负电的细胞表面相互作用，因此具有一定的细胞毒性、溶血效应和肝脏毒性，限制了其在生物医药领域的应用[4]。聚乙二醇（PEG）具有良好的生物相容性和亲水性，可对聚酰胺胺表面改性，一方面通过减少或者部分屏蔽聚合物表面的正电荷可降低聚酰胺胺细胞毒性[5]；另一方面，可延长药物载体在体内的循环时间，提高药物的生物利用度。复旦大学杨武利课题组将合成的超支化聚酰胺胺（h-PAMAM）和部分PEG化的超支化聚酰胺胺（h-PAMAM-g-PEG）按照一定的比例进行混合，并进行了基因转染的生物应用。结果表明，混合体系既提高了基因转染的效率又提高了材料的生物相容性[6]。对肿瘤细胞膜表面叶酸受体的深入研究表明，在多种肿瘤如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌和肾细胞癌等细胞膜表面，叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞；因此，叶酸分子偶联可赋予药物载体材料主动靶向性[7]。Qiao等[8]通过在聚（2-乙烯基）-4，4-二甲基吖内酯（PVDMA）上连接肿瘤靶向基团叶酸和荧光基团氨基-罗丹明B构建荧光纳米偶合物。荧光成像研究结果表明，制备的纳米偶合物能够识别靶向肿瘤细胞并能够监控肿瘤细胞表面的膜糖蛋白的过表达。 生物降解性是理想药物载体的重要特征。研究发现，人体细胞内还原性谷胱甘肽（GSH）的浓度为2～10 mmol/L，远大于细胞外GSH的浓度（2～10 μmol/L）[9]；对于肿瘤细胞，其细胞内GSH的浓度要比正常细胞内GSH浓度高4倍，这使得肿瘤细胞内外的还原电势存在较大差异[10]。Martello等[11]通过引入二硫键合成了8种不同类型的还原响应型超支化和线型聚酰胺胺，研究发现所有合成的超支化和线性聚酰胺胺几乎没有毒性；但含有二硫键的超支化聚酰胺胺在COS-7细胞中表现出比线性聚酰胺胺（PEI）更高的基因转染效率，且比线性PEI转染效率高两倍。针对聚合物纳米药物载体往往存在不可降解、靶向性不够以及生理条件下稳定性较差等问题，本文从理想药物载体设计角度出发，采用迈克尔加成“一锅法”聚合方法，通过引入功能性单体制备还原降解、肿瘤靶向的智能型超支化聚酰胺胺（FA-DHPAP，见图1）。这种基于超支化聚酰胺胺的智能药物载体不仅具有传统超支化聚酰胺胺的优点，而且由于引入了二硫键和表面接枝PEG和偶联叶酸，具有生物降解性、稳定性和肿瘤靶向性。本文以骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）为对象，研究了基于超支化聚酰胺胺的智能药物载体的生物相容性。
1 实验部分
1.1 原料与仪器
N，N′-双（丙烯酰）胱胺（BAC），AR，质量分数98%；1-（2-胺乙基）哌嗪（AEPZ），AR，质量分数98%；二硫苏糖醇（DTT），AR，质量分数99%；溴化噻唑蓝四氮唑（MTT），AR，质量分数98%；聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯（PEGMA，Mw 2 000 g/mol）、叶酸（FA），AR，质量分数96%；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl），AR，质量分数99%；N-羟基丁二酰亚胺（NHS），AR，质量分数98%；以上试剂均购于百灵威科技有限公司。N，N′-二甲基亚砜（DMSO）、甲醇、乙醚、三乙胺、丙酮等实验用有机溶剂为分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司；实验用水为二次蒸馏水。
动态光散射（DLS）和Zeta电位仪（Zetasizer Nano，Malven），英国马尔文仪器有限公司；核磁共振波谱仪（Bruker-500 MHz），瑞士Bruker公司；傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet Nexus-440），美国Nicolet公司；拉曼光谱仪（LabRam-1B），法国Dior公司；凝胶渗透色谱仪（GPC，Waters Breeze 1525），美国沃特斯公司；透射电镜（TEM，Hitachi H-600），日本日立公司；酶标免疫检测仪（EL311型），美国BioTek公司；水套式CO2孵箱（3164型），美国Forma Scientific公司。
1.2 实验步骤
1.2.1 还原降解性超支化聚酰胺胺（DHPAA）的合成与降解
以N，N′-双（丙烯酰）胱胺（BAC）与1-（2-胺乙基）哌嗪（AEPZ）为反应单体，采用“一锅法”迈克尔加成聚合反应制备得到还原降解性超支化聚酰胺胺（DHPAA）。具体步骤如下：室温下，将溶有1.5 mmol AEPZ的2 mL甲醇溶液滴加至含有1.5 mmol BAC的10 mL甲醇溶液中。混合物在50 ℃下搅拌反应6 d后，在剧烈搅拌下将反应混合物加入过量乙醚中进行沉淀。将沉淀通过离心分离后溶解至甲醇，在含有5%（V/V）浓盐酸的100 mL丙酮溶液中沉淀、真空干燥得白色粉末状固体（即DHPAA）。
称取合成的聚合物DHPAA 2.0 mg分散至二硫苏糖醇（DTT）为10 mmol/L的2 mL 0.01 mol/L、pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，密闭反应24 h，GPC跟踪表征。
1.2.2 PEG接枝、叶酸偶联的超支化聚酰胺胺（FA-DHPAP）的合成
PEG化的还原降解性超支化聚酰胺胺（DHPAP）的合成与DHPAA类似，不同的是反应5 d后，加入与AEPZ等物质量的PEGMA（1.5 mmol）甲醇溶液，在60 ℃继续反应3 d后按照与DHPAA相同的提纯方法进行纯化后得到DHPAP。
将摩尔比为1∶2.2∶2.2的叶酸（FA）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、以及N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，并加入少量的三乙胺，N2保护下、室温磁力搅拌过夜形成叶酸活性酯。将上述反应液缓慢加入DHPAP的DMSO溶液中（DHPAP与叶酸摩尔比为1∶6），室温避光反应1～2 d，粗产物在蒸馏水中透析纯化后冻干得到FA-DHPAP。
1.2.3 细胞毒性实验
细胞毒性实验的测量方法是常规的MTT法。选用间充质干细胞评价聚合物DHPAA和FA-DHPAP的生物相容性。MSCs细胞用DMEM（dulbecco’s modified eagle medium）培养介质在37 ℃、5% CO2氛围下培养，每3 d更换一次介质。细胞株以每孔1×104个细胞的密度接种到96孔培养板上，在含有5% CO2的湿润空气氛围下培养24 h后，弃去培养液，并用新鲜磷酸盐缓冲溶液洗涤2次，再分别加入新鲜的预定浓度的聚合物DHPAA和FA-DHPAP，平行操作3份。48 h后，吸去孔内的上清液，用新鲜PBS缓冲溶液洗涤后在每孔中加入20 μL MTT液体（5 mg/mL），在37 ℃继续培养4 h，终止培养。弃去上清液，每孔加150 μL DMSO，避光振荡10 min使结晶物充分溶解。使用自动酶标仪检测570 nm波长处的吸光度（A）值。细胞存活率按下式计算：
细胞存活率=■×100%
其中Asample，Acontrol和Ablank分别代表样品孔、对照孔和空白孔在570 nm处的吸光度值。样品孔为加入待测样品的细胞培养液，对照孔为未加待测样品的细胞培养液，空白孔为未加细胞的培养液。 2 结果与讨论
2.1 聚合物DHPAA的合成与性能表征
2.1.1 DHPAA的合成
聚合物DHPAA以BAC与AEPZ为反应单体，采用“一锅法”迈克尔加成聚合反应制备得到。在DHPAA的红外谱图（见图2（a））中，在3 436 cm-1处出现了来自AEPZ的氨基（-NH与-NH2）的伸缩振动峰，在1 654 cm-1处出现了酰胺的羰基（C=O）的伸缩振动峰。在DHPAA的拉曼光谱中（见图2（b）），在507 cm-1处出现了二硫键的（S-S）的吸收峰[12]。DHPAA在D2O中的13C-NMR谱图（见图3）表明，所合成的聚合物符合分子设计。
2.1.2 DHPAA的性能表征
还原降解性超支化聚酰胺胺与树枝状聚酰胺胺类似，表面带有大量的氨基（见图1），因此该材料表面具有大量的正电荷。Zeta电势结果（见图4）表明：DHPAA在不同pH的磷酸盐缓冲溶液中均带正电，表现出明显的pH响应性，电势随着pH值的升高而降低，从44 mV（pH 3.0）变化到11 mV（pH 9.0）。随着环境pH的增加，氢离子浓度降低，聚合物材料表面氨基所带正电荷减少，电势降低。
通过凝胶渗透色谱（GPC）跟踪聚合物DHPAA分子量在还原性环境中的变化来表征DHPAA的还原降解性。如图5（a）所示，聚合物DHPAA的分子量约为5 000。在DTT还原性环境中，随着时间的增长，聚合物DHPAA的分子量减小，24 h后由最初的4 800降为350（见图5（b））。GPC结果表明，在还原性环境中，聚合物DHPAA内部二硫键被还原为巯基而发生断裂[13]，因而被降解为小分子物质、易被排出体外，一定程度上降低了生理毒性，提高了生物相容性。
2.2 聚合物FA-DHPAP的合成与性能表征
2.2.1 聚合物FA-DHPAP的合成
聚乙二醇（PEG）通过迈克尔加成法共聚至DHPAA得到DHPAP，在此基础上通过酰胺化反应将叶酸连接至DHPAP得到FA-DHPAP。核磁结果（见图6）表明，3.5×10-6出现了来自PEG的特征峰[14]，8.66×10-6、6.60×10-6、4.45×10-6出现了来自叶酸的特征峰[15]，说明所合成的FA-DHPAP符合分子设计。
2.2.2 聚合物FA-DHPAP的性能表征
通过DLS，Zeta电位仪以及透射电镜（TEM）等进一步对聚合物DHPAA和FA-DHPAP进行性能表征以比较两者的性能差异。从表1看出，接枝PEG和偶联叶酸后的聚合物FA-DHPAP的Zeta电势为（1.9±0.5）mV，远低于DHPAA在pH 7.4环境中的Zeta电势。由于PEG的接枝和叶酸的偶联，聚合物DHPAA中氨基的数目减少引起正电荷减少；另外叶酸的偶联使得羧基增多，负电荷增多。这些均致使聚合物FA-DHPAP电势降低。
同时，从表1可看出，DLS测得的DHPAA粒径为5.0 nm，FA-DHPAP的粒径约为50 nm。对于聚合物DHPAA，其分子量约为5 000且易溶于水，在水中是以单分子存在，因此粒径较小。对于聚合物FA-DHPAP，PEG的接枝和叶酸的偶联使其分子量增大、分子粒径增大。聚合物FA-DHPAP的电镜图（见图7（a））表明，FA-DHPAP的粒径分布较宽，电镜下观察的粒径为（48±30）nm，与DLS测得的粒径分布（见图7（b））一致。从电镜图中可看出：较小的粒子约为20 nm，为聚合物FA-DHPAP的单分子粒径；较大的粒径约为80 nm，这表明少量的聚合物FA-DHPAP分子发生了聚集。
2.3 聚合物DHPAA和FA-DHPAP的生物相容性
由上述结果可知，聚合物FA-DHPAP不仅表面具有大量的氨基、可连接其他药物或者活性分子，还具有还原降解性和肿瘤靶向性，因此非常适合用作药物载体。由于生物相容性是影响药物载体应用性能的重要因素之一，本文研究了聚合物FA-DHPAP对骨髓间充质干细胞（MSCs）的48 h细胞毒性，并与聚合物DHPAA作比较。如图8所示，对于较低的浓度（0～200 μg/mL），聚合物DHPAA和FA-DHPAP对骨髓间充质干细胞（MSCs）的生长均没有表现出明显的抑制作用。当聚合物浓度较高时（500～1 000 μg/mL），FA-DHPAP表现出比DHPAA更好的生物相容性：聚合物DHPAA浓度为500 μg/mL和1 000 μg/mL时，MSCs细胞存活率分别为87.5%和82.8%；相比较而言，聚合物FA-DHPAP显示出较低的细胞毒性，500 μg/mL时MSCs细胞存活率为92.8%，1 000 μg/mL时MSCs细胞存活率为90.6%。
细胞毒性结果表明，聚合物DHPAA因带有正电容易与带负电的细胞表面相互作用，因此具有一定的细胞毒性；聚合物FA-DHPAP由于表面接枝PEG和偶联FA，减少或者部分屏蔽了聚合物表面的正电荷而降低了细胞毒性，因而是一种理想的抗肿瘤药物载体。
3 结束语
本文采用“一锅法”迈克尔加成聚合法成功合成了含有二硫键、可还原降解的超支化聚酰胺胺（DHPAA）。DHPAA表面具有大量的氨基，分子量约为5 000，在还原性介质DTT中能够降解为小分子物质。通过在DHPAA表面接枝共聚PEG和偶联叶酸制备得到基于超支化聚酰胺胺的智能型药物载体材料FA-DHPAP。DLS、Zeta电势和TEM结果表明，PEG的接枝和叶酸的偶联使其表面正电荷减少，粒径增大。MSCs细胞毒性结果表明，相比于聚合物DHPAA，聚合物FA-DHPAP的细胞毒性较小、生物相容性更好，是一种理想的抗肿瘤药物载体。
参考文献
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（编辑：莫婕）
关键词：超支化聚酰胺胺；还原降解；肿瘤靶向；药物载体
文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2016）07-0053-06
Abstract： Starting from the design of an ideal drug carrier， smart redox-degradable and tumor-targeted polymeric nanocarrier was fabricated by introducing functional monomers and using Michael addition polymerization and material surface modification. Firstly， redox-degradable hyperbranched polyamidoamine（DHPAA） was prepared by Michael addition polymerization taking N，N′-bis（acryloyl） cystamine and 1-（2-aminoethyl） piperazine as functional monomer. On this basis， graft copolymerization of polyethylene glycol and conjugation of folic acid were conducted on DHPAA to obtain stable and tumor-targeted smart hyperbranched polyamidoamine（FA-DHPAP）. The structure and performance of polymer DHPAA were characterized by FTIR， NMR， DLS， Zeta potentiometer， Raman spectrometer and GPC. The structure and performance of polymer FA-DHPAP were characterized by NMR， DLS， Zeta potentiometer and TEM. The biocompatibility of the polymer DHPAA and FA-DHPAP as drug carrier was further confirmed by cytotoxicity test. The results showed that the smart hyperbranched polyamidoamine（FA-DHPAP） is environment-responsive and has good biocompatibility， thus it has great potential to be used as drug carrier for the tumor therapy.
Keywords： hyperbranched polyamidoamine； redox-degradable； tumor-targeted； drug vehicle
0 引 言
肿瘤是威胁人类健康与生命的疾病之一，化疗仍是目前治疗肿瘤疾病的主要手段之一。随着材料科学与医学的发展，聚合物材料被广泛用于药物载体[1]。超支化聚酰胺胺由于制备简单、易分离提纯，内部具有空腔、表面具有大面末端氨基等特点，可用于包裹或者连接药物等活性分子，因此在药物传递和基因转染等生物医药领域得到了广泛研究[2-3]。然而，聚酰胺胺表面带有的大量正电荷易与带负电的细胞表面相互作用，因此具有一定的细胞毒性、溶血效应和肝脏毒性，限制了其在生物医药领域的应用[4]。聚乙二醇（PEG）具有良好的生物相容性和亲水性，可对聚酰胺胺表面改性，一方面通过减少或者部分屏蔽聚合物表面的正电荷可降低聚酰胺胺细胞毒性[5]；另一方面，可延长药物载体在体内的循环时间，提高药物的生物利用度。复旦大学杨武利课题组将合成的超支化聚酰胺胺（h-PAMAM）和部分PEG化的超支化聚酰胺胺（h-PAMAM-g-PEG）按照一定的比例进行混合，并进行了基因转染的生物应用。结果表明，混合体系既提高了基因转染的效率又提高了材料的生物相容性[6]。对肿瘤细胞膜表面叶酸受体的深入研究表明，在多种肿瘤如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌和肾细胞癌等细胞膜表面，叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞；因此，叶酸分子偶联可赋予药物载体材料主动靶向性[7]。Qiao等[8]通过在聚（2-乙烯基）-4，4-二甲基吖内酯（PVDMA）上连接肿瘤靶向基团叶酸和荧光基团氨基-罗丹明B构建荧光纳米偶合物。荧光成像研究结果表明，制备的纳米偶合物能够识别靶向肿瘤细胞并能够监控肿瘤细胞表面的膜糖蛋白的过表达。 生物降解性是理想药物载体的重要特征。研究发现，人体细胞内还原性谷胱甘肽（GSH）的浓度为2～10 mmol/L，远大于细胞外GSH的浓度（2～10 μmol/L）[9]；对于肿瘤细胞，其细胞内GSH的浓度要比正常细胞内GSH浓度高4倍，这使得肿瘤细胞内外的还原电势存在较大差异[10]。Martello等[11]通过引入二硫键合成了8种不同类型的还原响应型超支化和线型聚酰胺胺，研究发现所有合成的超支化和线性聚酰胺胺几乎没有毒性；但含有二硫键的超支化聚酰胺胺在COS-7细胞中表现出比线性聚酰胺胺（PEI）更高的基因转染效率，且比线性PEI转染效率高两倍。针对聚合物纳米药物载体往往存在不可降解、靶向性不够以及生理条件下稳定性较差等问题，本文从理想药物载体设计角度出发，采用迈克尔加成“一锅法”聚合方法，通过引入功能性单体制备还原降解、肿瘤靶向的智能型超支化聚酰胺胺（FA-DHPAP，见图1）。这种基于超支化聚酰胺胺的智能药物载体不仅具有传统超支化聚酰胺胺的优点，而且由于引入了二硫键和表面接枝PEG和偶联叶酸，具有生物降解性、稳定性和肿瘤靶向性。本文以骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）为对象，研究了基于超支化聚酰胺胺的智能药物载体的生物相容性。
1 实验部分
1.1 原料与仪器
N，N′-双（丙烯酰）胱胺（BAC），AR，质量分数98%；1-（2-胺乙基）哌嗪（AEPZ），AR，质量分数98%；二硫苏糖醇（DTT），AR，质量分数99%；溴化噻唑蓝四氮唑（MTT），AR，质量分数98%；聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯（PEGMA，Mw 2 000 g/mol）、叶酸（FA），AR，质量分数96%；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl），AR，质量分数99%；N-羟基丁二酰亚胺（NHS），AR，质量分数98%；以上试剂均购于百灵威科技有限公司。N，N′-二甲基亚砜（DMSO）、甲醇、乙醚、三乙胺、丙酮等实验用有机溶剂为分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司；实验用水为二次蒸馏水。
动态光散射（DLS）和Zeta电位仪（Zetasizer Nano，Malven），英国马尔文仪器有限公司；核磁共振波谱仪（Bruker-500 MHz），瑞士Bruker公司；傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet Nexus-440），美国Nicolet公司；拉曼光谱仪（LabRam-1B），法国Dior公司；凝胶渗透色谱仪（GPC，Waters Breeze 1525），美国沃特斯公司；透射电镜（TEM，Hitachi H-600），日本日立公司；酶标免疫检测仪（EL311型），美国BioTek公司；水套式CO2孵箱（3164型），美国Forma Scientific公司。
1.2 实验步骤
1.2.1 还原降解性超支化聚酰胺胺（DHPAA）的合成与降解
以N，N′-双（丙烯酰）胱胺（BAC）与1-（2-胺乙基）哌嗪（AEPZ）为反应单体，采用“一锅法”迈克尔加成聚合反应制备得到还原降解性超支化聚酰胺胺（DHPAA）。具体步骤如下：室温下，将溶有1.5 mmol AEPZ的2 mL甲醇溶液滴加至含有1.5 mmol BAC的10 mL甲醇溶液中。混合物在50 ℃下搅拌反应6 d后，在剧烈搅拌下将反应混合物加入过量乙醚中进行沉淀。将沉淀通过离心分离后溶解至甲醇，在含有5%（V/V）浓盐酸的100 mL丙酮溶液中沉淀、真空干燥得白色粉末状固体（即DHPAA）。
称取合成的聚合物DHPAA 2.0 mg分散至二硫苏糖醇（DTT）为10 mmol/L的2 mL 0.01 mol/L、pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，密闭反应24 h，GPC跟踪表征。
1.2.2 PEG接枝、叶酸偶联的超支化聚酰胺胺（FA-DHPAP）的合成
PEG化的还原降解性超支化聚酰胺胺（DHPAP）的合成与DHPAA类似，不同的是反应5 d后，加入与AEPZ等物质量的PEGMA（1.5 mmol）甲醇溶液，在60 ℃继续反应3 d后按照与DHPAA相同的提纯方法进行纯化后得到DHPAP。
将摩尔比为1∶2.2∶2.2的叶酸（FA）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、以及N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，并加入少量的三乙胺，N2保护下、室温磁力搅拌过夜形成叶酸活性酯。将上述反应液缓慢加入DHPAP的DMSO溶液中（DHPAP与叶酸摩尔比为1∶6），室温避光反应1～2 d，粗产物在蒸馏水中透析纯化后冻干得到FA-DHPAP。
1.2.3 细胞毒性实验
细胞毒性实验的测量方法是常规的MTT法。选用间充质干细胞评价聚合物DHPAA和FA-DHPAP的生物相容性。MSCs细胞用DMEM（dulbecco’s modified eagle medium）培养介质在37 ℃、5% CO2氛围下培养，每3 d更换一次介质。细胞株以每孔1×104个细胞的密度接种到96孔培养板上，在含有5% CO2的湿润空气氛围下培养24 h后，弃去培养液，并用新鲜磷酸盐缓冲溶液洗涤2次，再分别加入新鲜的预定浓度的聚合物DHPAA和FA-DHPAP，平行操作3份。48 h后，吸去孔内的上清液，用新鲜PBS缓冲溶液洗涤后在每孔中加入20 μL MTT液体（5 mg/mL），在37 ℃继续培养4 h，终止培养。弃去上清液，每孔加150 μL DMSO，避光振荡10 min使结晶物充分溶解。使用自动酶标仪检测570 nm波长处的吸光度（A）值。细胞存活率按下式计算：
细胞存活率=■×100%
其中Asample，Acontrol和Ablank分别代表样品孔、对照孔和空白孔在570 nm处的吸光度值。样品孔为加入待测样品的细胞培养液，对照孔为未加待测样品的细胞培养液，空白孔为未加细胞的培养液。 2 结果与讨论
2.1 聚合物DHPAA的合成与性能表征
2.1.1 DHPAA的合成
聚合物DHPAA以BAC与AEPZ为反应单体，采用“一锅法”迈克尔加成聚合反应制备得到。在DHPAA的红外谱图（见图2（a））中，在3 436 cm-1处出现了来自AEPZ的氨基（-NH与-NH2）的伸缩振动峰，在1 654 cm-1处出现了酰胺的羰基（C=O）的伸缩振动峰。在DHPAA的拉曼光谱中（见图2（b）），在507 cm-1处出现了二硫键的（S-S）的吸收峰[12]。DHPAA在D2O中的13C-NMR谱图（见图3）表明，所合成的聚合物符合分子设计。
2.1.2 DHPAA的性能表征
还原降解性超支化聚酰胺胺与树枝状聚酰胺胺类似，表面带有大量的氨基（见图1），因此该材料表面具有大量的正电荷。Zeta电势结果（见图4）表明：DHPAA在不同pH的磷酸盐缓冲溶液中均带正电，表现出明显的pH响应性，电势随着pH值的升高而降低，从44 mV（pH 3.0）变化到11 mV（pH 9.0）。随着环境pH的增加，氢离子浓度降低，聚合物材料表面氨基所带正电荷减少，电势降低。
通过凝胶渗透色谱（GPC）跟踪聚合物DHPAA分子量在还原性环境中的变化来表征DHPAA的还原降解性。如图5（a）所示，聚合物DHPAA的分子量约为5 000。在DTT还原性环境中，随着时间的增长，聚合物DHPAA的分子量减小，24 h后由最初的4 800降为350（见图5（b））。GPC结果表明，在还原性环境中，聚合物DHPAA内部二硫键被还原为巯基而发生断裂[13]，因而被降解为小分子物质、易被排出体外，一定程度上降低了生理毒性，提高了生物相容性。
2.2 聚合物FA-DHPAP的合成与性能表征
2.2.1 聚合物FA-DHPAP的合成
聚乙二醇（PEG）通过迈克尔加成法共聚至DHPAA得到DHPAP，在此基础上通过酰胺化反应将叶酸连接至DHPAP得到FA-DHPAP。核磁结果（见图6）表明，3.5×10-6出现了来自PEG的特征峰[14]，8.66×10-6、6.60×10-6、4.45×10-6出现了来自叶酸的特征峰[15]，说明所合成的FA-DHPAP符合分子设计。
2.2.2 聚合物FA-DHPAP的性能表征
通过DLS，Zeta电位仪以及透射电镜（TEM）等进一步对聚合物DHPAA和FA-DHPAP进行性能表征以比较两者的性能差异。从表1看出，接枝PEG和偶联叶酸后的聚合物FA-DHPAP的Zeta电势为（1.9±0.5）mV，远低于DHPAA在pH 7.4环境中的Zeta电势。由于PEG的接枝和叶酸的偶联，聚合物DHPAA中氨基的数目减少引起正电荷减少；另外叶酸的偶联使得羧基增多，负电荷增多。这些均致使聚合物FA-DHPAP电势降低。
同时，从表1可看出，DLS测得的DHPAA粒径为5.0 nm，FA-DHPAP的粒径约为50 nm。对于聚合物DHPAA，其分子量约为5 000且易溶于水，在水中是以单分子存在，因此粒径较小。对于聚合物FA-DHPAP，PEG的接枝和叶酸的偶联使其分子量增大、分子粒径增大。聚合物FA-DHPAP的电镜图（见图7（a））表明，FA-DHPAP的粒径分布较宽，电镜下观察的粒径为（48±30）nm，与DLS测得的粒径分布（见图7（b））一致。从电镜图中可看出：较小的粒子约为20 nm，为聚合物FA-DHPAP的单分子粒径；较大的粒径约为80 nm，这表明少量的聚合物FA-DHPAP分子发生了聚集。
2.3 聚合物DHPAA和FA-DHPAP的生物相容性
由上述结果可知，聚合物FA-DHPAP不仅表面具有大量的氨基、可连接其他药物或者活性分子，还具有还原降解性和肿瘤靶向性，因此非常适合用作药物载体。由于生物相容性是影响药物载体应用性能的重要因素之一，本文研究了聚合物FA-DHPAP对骨髓间充质干细胞（MSCs）的48 h细胞毒性，并与聚合物DHPAA作比较。如图8所示，对于较低的浓度（0～200 μg/mL），聚合物DHPAA和FA-DHPAP对骨髓间充质干细胞（MSCs）的生长均没有表现出明显的抑制作用。当聚合物浓度较高时（500～1 000 μg/mL），FA-DHPAP表现出比DHPAA更好的生物相容性：聚合物DHPAA浓度为500 μg/mL和1 000 μg/mL时，MSCs细胞存活率分别为87.5%和82.8%；相比较而言，聚合物FA-DHPAP显示出较低的细胞毒性，500 μg/mL时MSCs细胞存活率为92.8%，1 000 μg/mL时MSCs细胞存活率为90.6%。
细胞毒性结果表明，聚合物DHPAA因带有正电容易与带负电的细胞表面相互作用，因此具有一定的细胞毒性；聚合物FA-DHPAP由于表面接枝PEG和偶联FA，减少或者部分屏蔽了聚合物表面的正电荷而降低了细胞毒性，因而是一种理想的抗肿瘤药物载体。
3 结束语
本文采用“一锅法”迈克尔加成聚合法成功合成了含有二硫键、可还原降解的超支化聚酰胺胺（DHPAA）。DHPAA表面具有大量的氨基，分子量约为5 000，在还原性介质DTT中能够降解为小分子物质。通过在DHPAA表面接枝共聚PEG和偶联叶酸制备得到基于超支化聚酰胺胺的智能型药物载体材料FA-DHPAP。DLS、Zeta电势和TEM结果表明，PEG的接枝和叶酸的偶联使其表面正电荷减少，粒径增大。MSCs细胞毒性结果表明，相比于聚合物DHPAA，聚合物FA-DHPAP的细胞毒性较小、生物相容性更好，是一种理想的抗肿瘤药物载体。
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（编辑：莫婕）