探讨miR－494及其靶基因JunD在损伤疝出型椎间盘突出(IDH)中的表达及其临床意义。
方法收集脊柱爆裂骨折手术椎间盘标本6个，髓核细胞培养，不同浓度(0，10，50，100 ng/ml)肿瘤坏死因子－α(TNF－α)诱导髓核细胞凋亡，建立髓核细胞凋亡模型，于不同时相点(0，8，16，24 h)采用qRT－PCR和流式细胞术检测髓核细胞凋亡率及miR－494的表达。AntigomiR－494在慢病毒包装后转染髓核细胞，成功敲除髓核细胞miR－494后使用TNF－α(100 ng/ml，16 h)诱导髓核细胞凋亡。采用随机数字表法进行实验分组：空白对照组(髓核细胞)、AntigomiR－494＋TNF－α组、阴性对照＋TNF－α组。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。Western blot检测JunD蛋白和细胞色素C蛋白的表达情况。荧光素酶双报告基因分析技术及生物信息学方法了解miR－494与JunD基因的靶向关系。
结果miR－494表达量及髓核细胞凋亡率随TNF－α浓度和刺激时间的增加而增加(P<0.05)。与阴性对照＋TNF－α组相比，在细胞转染后，AntigomiR－494＋TNF－α组miR－494表达量和细胞凋亡率明显下降(P<0.05)。Western blot结果表明，AntigomiR－494＋TNF－α组JunD蛋白的表达水平较阴性对照＋TNF－α组高(P<0.05)，而细胞色素C蛋白的表达水平较阴性对照＋TNF－α组低(P<0.05)。荧光素酶双报告基因验证、生物信息学方法预测证实miR－494直接靶向JunD。
结论TNF－α可诱导髓核细胞的凋亡，且呈时间和剂量依赖性。髓核细胞miR－494的表达量随TNF－α的刺激浓度、时间增加而增加。miR－494有可能是髓核细胞在TNF－α诱导下凋亡的关键调节器。miR－494基因敲除可以保护髓核细胞，其可能机制是上调靶基因JunD，并且介导细胞色素C凋亡通路。miR－494－JunD－细胞色素C信号通路可能是椎间盘退变的潜在机制之一。