微孢子虫（microsporidia）是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,它们在自然界中分布广泛,能够寄生几乎所有的脊椎动物和无脊椎动物,是经济昆虫、鱼类、兔类、产毛动物、啮齿类及灵长类的常见病原。目前已经报道的微孢子虫约有150个属,1400余种。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）专性寄生于经济昆虫家蚕,可引发蚕业生产上的毁灭性病害——家蚕微粒子病,所以它一直被列为蚕业生产的唯一法定检疫对象。微粒子病和带毒蚕种每年都会给我国蚕业生产造成高达上千万元的经济损失。因此如何攻克微粒子病就成了蚕业界研究领域的重点和难点。本实验室近几年完成了家蚕微孢子虫重庆株CQ-1的全基因组测序工作,并绘制了其基因组框架图。在对全基因组序列进行信息分析时,我们发现了一个新的微孢子虫基因家族一ricinB-lectin家族,用这个家族的基因序列与其他已经报道过的微孢子虫,如兔脑炎微孢子虫、蝗虫微孢子虫、蜜蜂微孢子虫和肠道微孢子虫等的基因组数据进行比对,发现这些微孢子虫也有ricin B-lectin的同源基因,由此可见这种凝集素基因广泛分布在不同微孢子虫基因组内。考虑到微孢子虫的侵染特性及ricin B-lectin具有凝集作用的生物学功能,我们猜测这种基因可能在家蚕微孢子虫侵染宿主家蚕的过程中起着重要的作用。本研究旨在鉴定家蚕微孢子虫的ricin B-lectin基因,通过克隆表达获得ricin B-lectin蛋白,确定其在家蚕微孢子虫内的表达特征和亚细胞定位情况,为下一步的功能研究,继而进一步阐明家蚕微孢子虫的侵染机制及其与宿主的互作奠定基础。本研究首先利用生物信息学的研究手段,从家蚕微孢子虫的全基因组数据库中检索出所有的ricin B-lectin基因,并利用生物信息学分析软件和在线预测分析等方法对其性质和进化关系等进行了分析,根据分析结果,选定其中一条预测为编码分泌型蛋白的基因NBO₆g0069 （nbrtb649）,然后利用分子克隆和原核表达的方法,获得nbrtb649基因的体外重组蛋白NBRTB649,纯化后将其作为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体；进而通过western blot检测确定其在成熟孢子中的表达情况；最后通过间接免疫荧光试验（IFAT）和免疫电镜实验对NBRTB649在孢子内的表达特征和亚细胞定位进了行研究。主要的研究结果如下：1.家蚕微孢子虫ricin B-lectin基因的序列分析通过对本实验室建立的家蚕微孢子虫全基因组数据库的注释信息进行检索,共得到了19条ricin B-lectin候选基因,它们主要以串联重复的形式排列在NBO₆和NBO₄63这两条scaffolds上。利用相关生物信息学分析软件和方法对这些候选基因进行初步分析,发现除了NBO₆g0050、NBO₆g0108、NBO₉81g0001和NBO₁214g0002这四个蛋白外,其余15个均为分泌型蛋白,它们有可能被分泌到家蚕微孢子虫体外,参与家蚕微孢子虫与宿主家蚕的互作；除了NBO₆g0050和NBO₄63g0006外,其他17个序列均具有预测的糖基化位点,说明它们可能是具有糖结合的生物学活性,对19个蛋白质的氨基酸序列进行聚类和系统进化关系分析,可以看到它们分为3个亚家族,而且多组位于不同scaffolds上的两个ricin B-lectin均聚为一枝,说明它们可能是基因重复的产物。多重序列分析表明,虽然家蚕微孢子虫ricin B-lectin的氨基酸序列与其他物种的相似性很低,但是它们仍然具有典型的ricin B-lectin家族特征,即至少含有一个相对保守的（QxW）基序。用这些蛋白质序列与兔脑炎微孢子虫、蝗虫微孢子虫、蜜蜂微孢子虫和肠道微孢子虫的所有蛋白质序列进行BLAST比对,发现这些微孢子虫也具有ricin B-lectin基因,对其在染色体上的位置进行分析发现,兔脑炎微孢子虫和蜜蜂微孢子虫与家蚕微孢子虫一样,其ricin B-lectin基因也以串联重复的形式排列在染色体上。这表明,ricin B-lectin基因广泛存在于不同种的微孢子虫中,可能与微孢子虫的侵染相关。系统进化树分析表明在进化过程中,由于寄生环境的不同,不同微孢子虫的ricin B-lectin序列发生了较大的差异,而且可能是与不同的靶蛋白协同进化的结果。2.家蚕微孢子虫nbrtb649基因在不同感染时期的转录特征根据前面信息分析的结果,本文选取基因nbrtb649作为研究的对象,利用RT-PCR对nbrtb649基因在感染家蚕不同时期的转录情况进行研究,为下一步的研究打下基础。设计nbrtb649基因的特异引物,以被感染家蚕不同发育时期的中肠RNA反转录后的ss cDNA为模板进行PCR实验,结果表明在感染家蚕后的第一天到第十天均能检测到nbrtb649基因的转录活性,这说明nbrtb649可能在侵染的过程中发挥着重要的作用。3.家蚕微孢子虫nbrtb649基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备本研究在家蚕微孢子虫全基因组数据的基础上,根据前面的生物信息学分析结果,设计引物,对nbrtb649基因进行了克隆和原核表达。首先构建重组表达载体pGEX4T-1-nbrtb649,转化大肠杆菌表达菌株BL21并用诱导剂IPTG进行诱导表达,最终得到了重组的蛋白NBRTB649,并通过电洗脱和透析等方法对其进行纯化；然后用纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗血清并进行western blot检测,结果在家蚕微孢子虫总蛋白中检测到了一条特异的、分子量大小比预测大小稍微偏大的蛋白条带,这表明nbrtb649在家蚕微孢子虫中有表达,并且从出现的蛋白条带的带型来看,NBRTB649很可能是糖蛋白,其比预测的分子量偏大,可能正是因为被糖基化修饰的缘故。本研究的结果还验证了制备的抗血清可以用于NBRTB649蛋白在孢子内的定位表达研究。4.家蚕微孢子虫NBRTB649蛋白的亚细胞定位研究为了确定nbrtb649基因在孢子内的表达特征及其编码蛋白NBRTB649在家蚕微孢子虫内的亚细胞定位特点,本实验主要采用了间接免疫荧光试验（IFAT）和免疫电镜技术进行研究。分别将成熟孢子和经过发芽的孢子进行固定并用透化液处理后进行IFAT,结果表明,只能在成熟孢子内部观察到荧光信号,而孢子外壁和发芽后的孢壳没有信号,说明NBRTB649蛋白是一种孢子内部蛋白,而不是孢壁蛋白。将成熟孢子进行低温包埋后样品处理进行电镜观察,可以发现胶体金颗粒零散地分布在整个孢原质内,而不是集中地分布于某一细胞器结构。这从实验说明NBRTB649蛋白在成熟孢子内有表达,但是没有明显的细胞器定位特征。