骨肉瘤(Oseteosarcoma)亦称为成骨肉瘤,是一种常见于儿童和青少年时期的恶性原发性骨肿瘤。早期即可发生广泛的肺转移,死亡率高,是导致儿童和青少年死亡的最常见的疾病之一。其总体发病率各国统计数字差异较大,约1/10万~0.1/10万。尽管当前新的辅助化疗及手术技术有了进一步的发展和提高,骨肉瘤患者的生存率也因此显著提高了,但仍有部分患者会出现化疗效果差,容易复发和转移的情况。近年来,随着分子生物学研究和技术的不断发展,骨肉瘤的最新研究已进入基因治疗、靶向治疗阶段,从分子水平研究肿瘤中相关基因的表达对肿瘤的发生、演变、转归及治疗具有重要意义。目前在肿瘤生物基因靶向治疗及信号转导通路作用机制的研究方面出现了许多新的进展,这为我们对骨肉瘤的预防和治疗提供了新的方法和途径。ARHI(aplasia ras homologue member I),是一个母源性印记基因。它又被称为Di Ras3或NOEY2,于1999年被首次发现。近年来研究表明,其编码蛋白在人类的胰腺、乳腺、卵巢等多个组织中存在着不同的表达。但是,它在胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌等多种肿瘤中则表现为表达缺失或下调,提示ARHI基因与上述肿瘤的发生、发展具有相关性。ARHI基因作为一个抑癌基因,其在调控肿瘤细胞的生长增殖、侵袭迁移以及诱导细胞凋亡、干预细胞信号转导通路等方面扮演着重要角色。ARHI作为一种新的研究目的基因,为肿瘤的分子水平基因治疗探索提供了新的思路。ARHI基因在肿瘤中的应用研究尚处于初始阶段,迄今在国内外的研究领域尚无关于骨肉瘤中ARHI基因的表达和ARHI基因对骨肉瘤生物学特性影响及相关机制研究的文献报道。鉴于上述原因,本实验将通过构建目的基因ARHI稳定表达的骨肉瘤MG-63、U2OS和SAOS-2细胞系,对ARHI基因在骨肉瘤细胞中的表达情况作以研究,并以此为依据,深入探讨ARHI基因对骨肉瘤生物学特性的影响及其作用机制,以期为骨肉瘤的基因诊断及治疗提供更多理论支撑和依据。本研究共分为四部分:第一部分ARHI基因在人骨肉瘤细胞及正常成骨细胞中的表达及意义目的:研究ARHI基因在人骨肉瘤细胞及正常成骨细胞中的表达情况,探讨ARHI基因在人骨肉瘤中表达的生物学意义。方法:分为3种人骨肉瘤细胞系(MG-63、U2OS、SAOS-2)和人正常成骨细胞h FOB1.19,采用RT-PCR和Western blot法分别检测ARHI基因m RNA和蛋白的表达情况,对结果进行统计分析,揭示在正常的成骨细胞中是否存在ARHI基因的表达以及其在人骨肉瘤细胞中表达的变化情况。结果:(1)应用RT-PCR和Western blot法分别检测了骨肉瘤细胞系中ARHI基因m RNA及蛋白表达情况,结果显示其内均存有不同程度ARHI基因表达。(2)RT-PCR显示骨肉瘤细胞系中ARHI m RNA表达水平低于正常成骨细胞,以MG-63细胞下降最为显著,表达水平有显著性差异(P<0.05)。(3)Western blot法检测结果:骨肉瘤细胞系中ARHI蛋白表达水平低于正常成骨细胞,以MG-63细胞下降最为显著,表达水平有显著性差异(P<0.05)。结论:ARHI基因在骨肉瘤细胞系中普遍低表达,提示其表达可能与骨肉瘤的发生发展密切相关,影响骨肉瘤的生物学行为。第二部分ARHI基因转染骨肉瘤细胞阳性克隆稳定株的构建及鉴定目的:构建稳定表达目的基因ARHI的骨肉瘤细胞系模型并进行鉴定,为研究ARHI基因对骨肉瘤细胞生物学行为的影响奠定基础。方法:应用基因克隆技术,构建真核表达载体pc DNA3.1-ARHI(携带目的基因ARHI基因编码序列),将ARHI基因重组质粒pc DNA3.l-ARHI和空载体质粒pc DNA-3.1分别经转化大肠杆菌、质粒提取扩增和纯化鉴定后,采用脂质体法分别瞬时转染骨肉瘤细胞系MG-63、U2OS、SAOS-2,通过G418筛选,建立稳定转染ARHI基因的骨肉瘤细胞系模型。扩增培养后应用RT-PCR及Western blot法分别检测骨肉瘤MG-63、U2OS、SAOS-2细胞转染前后目的基因ARHI在m RNA和蛋白表达水平的变化。结果:(1)真核表达质粒pc DNA3.l-ARHI转染骨肉瘤细胞系和空载体pc DNA3.l转染骨肉瘤细胞系均获得新霉素抗性,通过G418筛选,建立了稳定转染ARHI基因的骨肉瘤细胞系。(2)通过RT-PCR、Western blot法检测显示重组质粒pc DNA3.l-ARHI转染骨肉瘤细胞系后,目的基因ARHI在m RNA和蛋白质水平上的表达均较空载体组和未转染组有显著增高(P<0.05),而空载体组和未转染组的ARHI表达则没有明显不同(P>0.05)。结论:应用基因克隆技术在体外成功构建能够稳定表达目的基因ARHI的骨肉瘤细胞系。第三部分ARHI基因调控骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭迁移的体外研究目的:研究目的基因ARHI对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭迁移的影响,证实其在骨肉瘤中的生物学作用。方法:以成功构建的分别能稳定表达外源pc DNA3.1-ARHI、空载体pc DNA3.1的骨肉瘤细胞系和未转染的骨肉瘤细胞系为研究对象。(1)通过生长曲线和MTT法分析ARHI基因对骨肉瘤细胞增殖的影响;(2)流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染色法检测ARHI基因对骨肉瘤细胞凋亡的影响。(3)通过Transwell小室侵袭实验和Transwell小室迁移实验研究ARHI基因对骨肉瘤细胞侵袭迁移的影响。结果:(1)从骨肉瘤MG-63、U2OS、SAOS-2细胞的生长曲线数据分析,ARHI组细胞生长速度要比空载体组明显减慢,ARHI基因抑制了骨肉瘤细胞的生长,尤其在72~96h,与空载体组比较,具有明显的差异性(P<0.05)。(2)应用MTT法检测细胞生长,可见ARHI组细胞生长明显减慢,对MG-63、U2OS和SAOS-2细胞均有明显的生长抑制作用,ARHI组与空载体组比较,具有明显的差异性(P<0.05)。(3)Annexin V-FITC/PI双染色后用流式细胞仪检测骨肉瘤细胞凋亡情况,定量分析骨肉瘤MG-63细胞的凋亡率,结果发现ARHI组MG-63凋亡细胞的百分率为29.7%,空载体组为4.31%。与空载体组比较,ARHI基因明显增加了细胞凋亡百分率(P>0.05)。(4)通过Transwell侵袭实验可以观察到MG-63细胞在ARHI组较空载体组细胞侵袭能力明显下降(P<0.05);通过Transwell迁移实验可以观察到MG-63细胞在ARHI组较空载体组细胞迁移能力明显下降(P<0.05)。结论:(1)ARHI基因抑制骨肉瘤细胞的增殖;(2)ARHI基因诱导骨肉瘤细胞发生凋亡;(3)ARHI基因抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移;(4)ARHI基因在骨肉瘤发生发展过程中是一个抑癌基因。第四部分小干扰RNA对骨肉瘤细胞ARHI基因、蛋白表达及细胞增殖、凋亡的影响以及ARHI基因对PI3K/Akt信号通路的影响目的:研究小干扰RNA对骨肉瘤MG-63细胞ARHI基因的表达水平及细胞增殖、凋亡的影响;研究ARHI基因对PI3K/Akt信号通路和Caspase凋亡信号通路的影响。方法:使用化学合成法构建针对ARHI的小干扰RNA,通过使用dharmafect4转染试剂将其转染入ARHI高表达的骨肉瘤MG-63细胞。(1)通过RT-PCR、Western blot方法、MTT增殖实验及流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染色法检测其对ARHI基因、蛋白表达水平及细胞增殖、凋亡的影响;(2)通过Western blot方法检测ARHI基因对PI3K/Akt信号转导通路中p-Akt和Akt蛋白表达的作用;(3)通过Caspase-Glo?3/7试验检测ARHI基因对Caspase-3活性的影响。结果:(1)成功构建了针对ARHI基因的小干扰RNA;(2)通过RT-PCR检测显示,ARHI si RNA转染MG-63细胞48h后,与control si RNA转染组比较,ARHI si RNA转染组细胞中ARHI m RNA的表达水平下降约92%,具有明显差异性(P<0.05);(3)通过Western blot方法检测显示,与control si RNA转染组比较,ARHI si RNA转染组MG-63细胞中ARHI蛋白表达水平下调,具有明显差异性(P<0.05);(4)应用MTT比色法检测显示,ARHI si RNA转染组细胞增殖较control si RNA转染组有所增加,具有明显差异性(P<0.05);(5)流式细胞仪检测显示,ARHI si RNA转染48h后MG-63细胞的凋亡率4.8%,明显低于control si RNA转染组31.1%,具有显著差异性(P<0.05);(6)在ARHI基因转染MG-63细胞72h后,观察p-Akt蛋白的表达,结果显示骨肉瘤细胞转染ARHI基因后,与空载体比较,发现磷酸化的p-Akt蛋白表达明显下调,而通过RNAi技术使ARHI基因沉默则显著上调了p-Akt蛋白表达,然而control si RNA转染组p-Akt蛋白表达无明显改变;(7)Caspase-Glo?3/7试验检测ARHI基因转染组与ARHI基因沉默组细胞中Caspase-3活性均较对照组无显著改变(P>0.05)。结论:(1)成功地合成了ARHI si RNA并将其转染入骨肉瘤MG-63细胞;(2)发现ARHI si RNA能下调骨肉瘤MG-63细胞ARHI基因和蛋白的表达水平,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡;(3)ARHI基因下调了p-Akt蛋白的表达,通过抑制PI3K/Akt信号转导通路参与骨肉瘤发生发展过程;(4)ARHI基因引起MG-63细胞凋亡可能与Caspase途径无关,具体机制还需进一步研究。