目的：利用体外重编程技术的独特优势，诱导生成急性髓系白血病源性多能干细胞（iPSC），为研究急性白血病的发病机制，寻找靶向治疗策略，以及制定个体化治疗方案提供技术平台。方法：1、含OCT4, SOX2, C-MYC和KLF4（简称OSCK）四个转录因子的慢病毒载体（亦称为主质粒）购自上海斯丹赛生物技术有限公司，通过RT-PCR和酶切鉴定方法验证其插入序列正确。主质粒加上两个辅助质粒pCMV-dR8.91和pCMV-VSV-G以及293T包装细胞，应用X-tremeGENE HP DNA TransfectionReagent转染试剂盒包装慢病毒并测定慢病毒滴度。2、利用CF-1小鼠制备饲养层细胞并检测其辅助干细胞生长的作用。3、用含OSCK四种因子的慢病毒混合液持续感染HL60细胞24小时，接着转移细胞至铺有CF-1饲养细胞层的6孔板内，直到长出细胞克隆。4、抽取一名急性髓性白血病M4患者的静脉血，制备单个核细胞悬液，经CD3+免疫磁珠阴性筛选去除T淋巴细胞后，置于含hSCF、hFLT3L、IL-3三种细胞因子的RPMI1640培养液中进行体外扩增，共培养4天后加入含OSCK四种因子的慢病毒混合液持续感染24小时，病毒感染倍数分别为2:1、5:1、10:1，接着转移细胞至铺有CF-1饲养细胞层的6孔板内，加入含bFGF(10μg/μl)的hES培养液培养7天后，换为hES条件培养液继续培养，直至生长出ES样细胞克隆。5、手术切取一名急性髓性白血病M6患者的白血病皮肤浸润病灶，经体外培养扩增2代后，应用流式细胞仪检测细胞表面的髓系标志物和红系标志物如CD13, CD33, CD71, CD235a等抗原表达。接着将扩增细胞用含OSCK四种因子的慢病毒感染，感染倍数分别为5:1、10:1、20:1，感染24小时后，转至铺有CF-1饲养细胞层的6孔板，加入含有bFGF(10μg/μl)的hES培养液培养7天，换为hES条件培养液再培养22天左右，直至生长出适当大小的iPS细胞克隆，从中先后挑取6株克隆，应用碱性磷酸酶染色初步鉴定其干细胞特性。6、从5株iPS细胞克隆中，选取2株，应用流式细胞仪检测细胞的免疫表型，毛细管电泳荧光检测片段分析技术检测细胞STR等位基因变化以明确iPS细胞的来源。通过免疫染色检测碱性磷酸酶、NANOG、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81干细胞相关标志，PCR检测OCT4、SOX2、C-MYC、KLF4、Nanog、Lin28、FOXD3等干细胞相关基因，亚硫酸氢钠基因组测序法分析OCT4启动子区去甲基化变化等来评价所诱导的iPS细胞的干细胞特性。通过拟胚体和畸胎瘤实验来了解iPS细胞的多向分化潜能；通过STR和染色体核型分析来明确诱导过程中是否发生畸变；结果：1、经PCR和酶切技术证实插入慢病毒载体的转录因子序列正确，接着成功包装出表达OSCK四种因子的慢病毒，病毒滴度均在106TU/ml以上，满足体外重编程技术要求。2、应用CF-1小鼠成功制备了适于干细胞培养的饲养细胞——小鼠胚胎成纤维细胞。3、HL60细胞在慢病毒诱导后14天就见有较大的细胞克隆形成，且该细胞克隆CD34+阳性细胞比例从诱导前的1.77%上升至诱导后的98.42%，提示在HL60细胞内也发生重编程变化。4、自急性白血病M4患者的外周血分离获得的单个核细胞经诱导后13天，生成的细胞克隆呈现出排列紧密、边界清晰、核质比增高的类似干细胞的形态特征，但由于细胞随后迅速分化，未能作进一步的功能鉴定。5、利用来自急性白血病M6患者浸润的皮肤组织中提取白血病细胞，成功建立急性白血病M6源性iPS细胞，流式细胞仪检测提示诱导前细胞表达髓系抗原CD13、CD117及红细胞抗原CD71、CD235a，然而诱导后这些抗原的表达减低或消失。碱性磷酸酶染色初步鉴定所诱导生成的细胞克隆具有多能干细胞特性，更深入的分析证实iPS细胞克隆表达NANOG, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81等多种干细胞标志；内外源性基因检测提示OCT4, SOX2二因子外源性基因表达下降或沉默，而内源性基因表达阳性；OCT4基因启动区去甲基化分析显示发生了去甲基化改变，以上均提示iPS细胞核内获得了重编程变化。拟胚体培养和畸胎瘤试验提示iPS细胞具备向三个胚层分化的潜能。STR和染色体核型分析显示iPS细胞经10代以上连续培养，其核型正常未发生畸变。结论：1、成功包装含OSCK四种因子的慢病毒及干细胞培养所需的饲养层细胞。2、 HL60细胞在被诱导后第14天形成了特别的细胞克隆，且其CD34+细胞比例较诱导前显著提高。急性白血病M4患者的外周血细胞诱导后可见形态类似多能干细胞的细胞克隆生成，但未能有效建立永生化的多能干细胞系。3、成功建立M6型急性白血病源性iPS细胞系，诱导过程中未发生染色体畸变和STR位点等位基因突变。