炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）包括溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）,是一组慢性肠道炎症性疾病,其病因尚未完全阐明,一般认为包括感染在内的环境因素作用于具有多基因缺陷的易感倾向个体,诱发异常免疫反应而导致的疾病。流行病学和临床研究均显示IBD具有遗传易感倾向,IBD发病呈家族聚集现象,感染者的一级亲属比普通人群有较高发病率;单卵双胎发病的一致性比率明显高于双卵双胎;不同人群发病率存在广泛差异,这些均表明IBD的发生与遗传因素密切相关。近年发展起来的全基因组扫描研究和候选基因研究也均证实IBD的发病具有遗传易感性,全基因组扫描结果显示IBD易感区分布于第1、3、4、5、6、7、10、12、14、16、19号和X染色体上,根据它们最初报道和证实日期,第16q、12、6、14、5、19、1、16p和10号染色体中的易感区分别被命名为IBD1-9,提示IBD为一多基因参与的复杂疾病。杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR）基因家族位于染色体19q13.4的IBD6连锁区域内。KIR主要表达于NK细胞、γδ⁺T细胞和记忆/效应αβ⁺T细胞（通常为CD8⁺T细胞和一些CD4⁺T细胞）,可以特异性识别人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）I类抗原,二者结合传导抑制性/激活性信号,调控自然杀伤细胞（natural killer cell,NK细胞）和部分T细胞的杀伤功能。KIR分为两大类:激活性KIR（activate KIR,aKIR）和抑制性KIR（inhibitory KIR,iKIR）。具有特异性HLA I类抗原配体的iKIR是NK细胞自身耐受的重要调节者。临床研究表明KIR与肿瘤免疫、病毒感染、母胎免疫耐受、骨髓移植和自身免疫性疾病有关。累积出现的证据表明KIR有助于自身免疫性疾病的发病机制,如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、关节强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、硬皮病等。最近研究表明,在IBD患者中,发生类风湿关节炎、强直性关节炎、银屑病性关节炎和多发性硬皮病等的危险性较高,提示IBD可能与其它自身免疫性疾病共有一个潜在的发病机制。HLA-Cw属于经典的HLA I类基因,可被杀伤细胞KIR特异性识别,参与调控NK细胞及一部分T细胞的功能。研究发现降低NK细胞抑制作用的KIR和HLA I联合能够增加自身免疫疾病的易感性和增强感染性疾病的抵御能力。目前,有关IBD的KIR基因研究国内外文献罕有报道,本课题以iKIR为候选基因,探讨iKIR-HLA-Cw联合与IBD易感性关系;并把HLA-Cw*0602基因克隆表达在HLA I类分子阴性的K562细胞上,观察其对外周血NK细胞杀伤活性和PBMCs分泌IFN-γ的影响,旨在深入探讨iKIR及其配体HLA-Cw在IBD发病过程中所起的作用,为临床治疗提供理论依据。研究目的1.分析IBD患者iKIR基因多态性,探讨iKIR基因多态性与IBD的关联性。2.分析iKIR及其配体HLA-Cw在IBD患者中的表型分布,探讨iKIR-HLA-Cw联合与IBD遗传易感性的关系。3.观察iKIR-HLA-Cw受体配体联合对外周血自然杀伤细胞（natural killercell,NK）细胞毒活性影响和对外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclearcells,PBMC）分泌IFN-γ的影响,探讨iKIR-HLA-Cw如何参与IBD的发病过程,为今后IBD疾病的基因治疗提供理论依据实验方法1.iKIR基因分型收集2006年10月～2008年1月于郑州大学第二附属医院、河南省中医学院第一附属医院、新乡市中心医院、苏州市立医院就诊的UC患者100例,CD患者73例,全部病例根据病史、症状、体征、电子结肠镜检查/消化道造影、组织病理学确诊。均符合2007年济南IBD的诊断标准。排除其他自身免疫系统疾病、病毒感染性疾病和肿瘤疾病。另选106例年龄、种族、性别匹配的无血缘关系的随机健康个体为健康对照组,采外周静脉血3mL,乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA）抗凝,以血液基因组DNA提取试剂盒（北京Tiangen生化科技有限公司）提取DNA。iKIR基因分型采用序列特异性引物聚合酶链反应（sequencespecific primer polymerase chain reproduction,PCR-SSP）方法。iKIR基因共8个,分别是KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3。引物由上海Sangon生物工程公司合成。根据分型结果,得出iKIR基因在IBD患者和健康人群中的表达,比较两者之间的差异。2.HLA-Cw基因分型及iKIR-HLA-C受体配体联合分析HLA-Cw基因分型采用美国Invitrogen公司提供的HLA-C LOCUS SSPUNITRAY^?试剂盒,采用PCR-SSP方法。根据Invitrogen公司配制的分析软件UniMatch,导入最新Lot升级软件,进行分析特异性产物大小,判定HLA-Cw基因型别,并分析不同iKIR与其相应的HLA-Cw配体联合（iKIR-HLA-Cw）在IBD患者和健康人群中的分布。3.HLA-Cw基因真核细胞表达载体的构建、鉴定及表达从一健康人外周血细胞中提取总RNA,RT-PCR方法扩增HLA-Cw*0602的cDNA,与pMD-19载体连接,转化,提取质粒pMD19/HLA-Cw*0602,测序鉴定后,亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,利用lipofectamine 2000转染K562细胞、G418筛选阳性克隆。RT-PCR检测HLA-Cw基因的表达,FACS检测HLA-Cw分子的细胞表面表达。4.HLA-Cw对IBD患者外周血NK细胞杀伤活性和PBMC分泌IFN-γ的影响①FACS分析IBD组和对照组的PBMC表面KIR2DL1的表达。②采用LDH释放法,分析IBD患者组和对照组（KIR2DL1阳性）外周血NK细胞对转染了HLA-Cw*0602的K562细胞（K562-HLA-Cw*0602细胞）和空质粒的K562细胞的细胞毒作用结果。③采用ELISA方法,分析IBD患者组和对照组（KIR2DL1阳性）PBMCs与K562-HLA-Cw*0602细胞作用后对IFN-γ分泌的影响。结果1.iKIR基因分型100例UC患者中iKIR基因表现型频率分别为KIR2DL1（0.710）、KIR2DL2（0.150）、KIR2DL3（0.620）、KIR2DL4（1.000）、KIR2DL5（0.230）、KIR3DL1（1.000）、KIR3DL2（1.000）、KIR3DL3（1.000）。73例CD患者中iKIR基因表现型频率分别为KIR2DL1（0.740）、KIR2DL2（0.164）、KIR2DL3（0.767）、KIR2DL4（1.000）、KIR2DL5（0.192）、KIR3DL1（0.973）、KIR3DL2（1.000）、KIR3DL3（1.000）。框架基因（KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3）出现在每个人中。与健康对照组比较,UC病例组中KIR2DL1和KIR2DL3表现型频率均显著降低（P=0.001）;CD病例组中KIR2DL1表现型频率显著降低（P=0.007）。而其它各iKIR基因频率无明显差异。2.HLA-Cw基因分型及iKIR-HLA-C受体配体联合分析运用PCR-SSP方法对IBD患者和健康对照组的HLA-Cw基因进行分型,共检测出HLA-Cw位点的20种基因型。进行iKIR-HLA-Cw联合分析发现,KIR2DL2/KIR2DL3-HLA-C1是最常见的抑制性受体配体对。在UC和CD患者组,KIR2DL1-HLA-C2的表现型频率分别为0.380、0.411,与健康对照组比较均显著下降（P=0.005和P=0.030）;而KIR2DL2/KIR2DL3-HLA-C1在IBD患者组与对照组比较无显著差异。在本研究中,存在着KIR和HLA表现型分离的现象。UC患者中表现KIR2DL1、KIR2DL2/KIR2DL3而不表现其相应HLA配体者分别0.330、0.060,表现HLA-C1、HLA-C2而不表现相应iKIR分别为0.200、0.100;CD患者中表现KIR2DL1、KIR2DL2/KIR2DL3而不表现其相应HLA配体者分别0.329、0.137,表现HLA-C1、HLA-C2而不表现相应iKIR分别为0.151、0.110,与健康对照组比较均无显著差异。3.HLA-Cw基因真核细胞表达载体的构建、鉴定及表达测序表明,克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中的HLA-Cw等位基因是HLA-Cw*0602,该分子在K562细胞株获得高效表达。4.HLA-Cw对IBD患者外周血NK细胞杀伤活性和PBMC分泌IFN-γ的影响①在健康对照组,KIR2DL1的表达率为（31.78±10.42）%,与健康对照组比较,UC组KIR2DL1表达率（45.90±16.52）%和CD组KIR2DL1表达率（44.39±13.30）%均显著下降（P=0.035和P=0.033）。②在IBD患者组和健康对照组,与转染了空质粒的K562细胞相比,外周血NK细胞对K562-HLA-Cw*0602细胞的杀伤活性明显下降（P=0.000）,当用KIR2DL1受体的单抗预先阻断后,NK细胞杀伤活性显著升高（P=0.000）。UC和CD患者组NK细胞对K562-HLA-Cw*0602细胞的杀伤活性均比健康对照低,差异具显著性（P=0.000）。③在IBD患者组和健康对照组,与转染了空质粒的K562细胞相比,PBMC对K562-HLA-Cw*0602细胞作用后分泌的IFN-γ显著下降（P=0.000）。UC组和CD组的PBMC对空质粒的K562细胞作用后,IFN-γ的分泌均比对照组显著升高（P=0.000）。结论1.UC组中KIR2DL1和KIR2DL3表现型频率均显著降低,提示KIR2DL1和KIR2DL3频率下降与UC的易感性相关;CD组中KIR2DL1表现型频率显著降低,提示KIR2DL1基因频率下降与CD易感性相关。2.在UC和CD患者组,KIR2DL1-HLA-C2的表现型频率均显著下降。KIR2DL1-HLA-C2联合下降,将使NK细胞和部分杀伤性T细胞缺乏足够的抑制信号,从而对自身细胞产生攻击,最终导致自身免疫的发生。提示:KIR2DL1-HLA-C2联合减少与UC和CD的易感性相关。3.在本研究中,存在着KIR-HLA表现型分离的现象。4.UC组和CD组中PBMC细胞表面KIR2DL1表达率均显著升高,可能反映了机体本身的一种病理状态。5.表达HLA-Cw*0602分子的K562细胞（K562-HLA-Cw*0602）可通过与KIR2DL1结合,明显抑制NK细胞的杀伤效应。UC和CD患者组NK细胞对K562-HLA-Cw*0602细胞的杀伤活性均比健康对照低,这与UC组和CD组的NK细胞表面KIR2DL1的高表达有关。6.表达HLA-Cw*0602分子的K562细胞可通过与KIR2DL1结合,明显抑制PBMCs分泌IFN-γ。UC患者组和CD患者组PBMCs对空质粒的K562细胞作用后分泌的IFN-γ比健康对照组显著升高,表明IFN-γ的升高与UC和CD的发病均相关。创新点1.目前,有关iKIR基因多态性及其配体HLA-Cw在IBD的研究罕有报道。本课题探讨IBD患者iKIR基因多态性,并与其配体HLA-Cw相结合,研究iKIR与HLA-Cw受体配体联合（iKIR-HLA-Cw）与IBD易感性的关系。2.通过把HLA-Cw*0602基因转染到K562细胞上,检测外周血NK细胞对靶细胞K562、K562-HLA-Cw杀伤活性和PBMC分泌IFN-γ的影响,我们把iKIR-HLA-Cw信号传导途径与NK细胞的生物学功能密切结合起来,探讨了iKIR-HLA-Cw在IBD发病过程中的作用,更进一步说明了iKIR-HLA-Cw受体配体对与IBD易感性的关系,为今后开展对IBD患者的基因治疗提供可靠的理论依据。