论文部分内容阅读
漆酶是一种含铜离子的木质素降解酶，催化的底物范围广泛，有重要的工业应用价值。本实验室从浙江东海20-30米处淤泥中分离得到一株高产漆酶的真菌，鉴定为内生拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.），并命名为J63。本文重点考察了该菌株在液体中发酵产漆酶的特性，并分离纯化出其中的一种漆酶同工酶Laccase1，考察了该种漆酶的酶学特性。 首先对Pestalotiopsis sp.J63菌种发酵产酶条件进行了研究，重点考察了该菌株利用农业废弃物产漆酶的情况和合适的培养基组成，结果表明在培养基中加入3 g/L麦芽糖、20 g/L稻草粉和2g/L麸皮并加入0.09 mM苯酚诱导后，可使漆酶酶活达到了5791.7 U/L。利用Native-PAGE分析漆酶同工酶时发现，该菌种可产生两种漆酶的同工酶（Laccase1和Laccase2）。诱导剂苯酚、愈创木酚及藜芦醇不仅能够加强Laccase1的表达，而且能够诱导Laccase2的表达，从而使酶活得到大幅度提高。无机盐能够促进Pestalotiopsis sp.J63产漆酶，其中H3BO3、SrCl2·6H2O、NaF和KBr均能使酶活提高200％以上。该菌种产漆酶的最适温度为26℃，最适的产酶pH为6.0。 其次，建立了一条从Pestalotiopsis sp.J63发酵液中分离纯化漆酶的技术路线。通过絮凝和超滤两步初级分离纯化，基本去除了发酵液中离心法无法去除的悬浮物质，并使发酵液浓缩。然后，选用DEAE Sepharose Fast Flow进行离子交换层析，优化后的层析条件为选用pH6.0 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液，流速0.5ml/min，采用阶跃方式洗脱。把收集到的DEAE Sepharose Fast Flow洗脱峰中含有漆酶活性的部分，再进行Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析，最终的漆酶纯化倍数和回收率分别为14.54和15.27％。经SDS-PAGE和Native-PAGE分析发现，产品中为单一的漆酶条带(Laccase1)。经测定并计算，该漆酶的相对分子质量为52.4 kDa。 第三，测定了Laccase1的酶学性质，发现其最适反应温度为60℃，且在60℃时热稳定性较好，保温180 min后仍保留了46.5％的酶活性。最适反应pH为3.0，在pH3.5-6的范围内漆酶较稳定，36h后仍然能够保持50％以上的酶活。同时，考察了12种无机盐对酶活的影响，除FeSO4·7H2O外其余11种无机盐对漆酶的酶活没有负影响，ZnSO4·7H2O、KBr、KAl(SO4)2·12H2O、MnCl2·4H2O等甚至能使酶活提高10％以上。最后，以ABTS作为底物，在pH4.5、反应温度20℃的条件下测定米氏常数得到Vmax=5.34μ M/min，Km=104.5μM。