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目的:糖尿病可引起非酒精性脂肪性肝病(NAFLD),如不加以干预,常进展为肝纤维化、肝硬化,目前糖尿病性肝纤维化的发病机制尚不完全清楚,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的激活、转分化是纤维化发生的核心环节。我们通过在体外高糖条件下培养大鼠肝星状细胞,探讨Rho A/ROCK通路在高糖刺激肝星状细胞增殖和转分化中的作用及ROCK对MAPKs通路的调控作用,旨在为临床糖尿病肝纤维化提供新的治疗靶点。方法:购买SD大鼠肝星状细胞株HSC-T6进行体外培养并用无血清培养基同步化2h,实验设为对照组(NG:含5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG:含25 mmol/L葡萄糖)、高渗透压组(HOSM:5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)、HG+法舒地尔组(12.5、25、50μmol/L)。应用MTS法测定肝星状细胞的增殖;免疫细胞化学染色测定α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达程度;应用Western blot方法分别检测肌球蛋白磷酸酯酶靶点亚单位1(MYPT1)、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK的磷酸化水平及总蛋白表达。结果:1高糖和法舒地尔对肝星状细胞增殖的影响从MTS结果可知:对照组的吸光度值为1.491±0.058,高糖组的吸光度为1.866±0.083,较对照组增加了20.1%(P<0.01);HG+法舒地尔(12.5、25、50μmol/L)组的吸光度分别为1.783±0.018、1.736±0.052、1.572±0.039,与高糖组相比分别降低了4.4%、7%和15.8%(P<0.01),三实验组细胞增殖受抑制程度也有差异(P<0.01);高渗透压组的吸光度为1.513±0.084,与对照组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。这些结果提示:高糖可以促进肝星状细胞增殖,应用法舒地尔能够浓度依赖性地抑制高糖诱导的肝星状细胞增殖,单纯高渗透压状态对细胞增殖没有影响。2高糖和法舒地尔对肝星状细胞内α-SMA合成的影响通过免疫细胞化学染色法观察肝星状细胞中α-SMA的阳性表达率。在染色阳性的细胞内可见胞核呈空泡状,核周胞浆处有黄褐色至棕褐色颗粒呈片状分布。对照组可见少量细胞微弱表达α-SMA,平均阳性表达率为11±0.540%,高渗透压组为13±0.852%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);高糖组的细胞染色呈强阳性,α-SMA阳性表达率为31±0.332%,明显高于对照组(P<0.01);在高糖中加入不同浓度的法舒地尔,其α-SMA较单纯高糖组均明显下降(P<0.01),且呈浓度依赖性(三实验组相比P<0.01)。结果提示:正常糖浓度和单纯高渗透压条件下,肝星状细胞处于静止状态,仅微弱表达α-SMA,而高糖可以将肝星状细胞激活并转分化为肌成纤维细胞大量合成α-SMA,应用法舒地尔能浓度依赖性的抑制高糖诱导的α-SMA的合成。3高糖和法舒地尔对ROCK通路的影响MYPT1是ROCK通路的重要底物,它的磷酸化标志着ROCK通路的激活,通常应用MYPT1磷酸化的水平来反应ROCK通路的活化程度。Western blot结果显示高渗透压组MYPT1磷酸化水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);高糖组MYPT1磷酸化水平较对照组明显增高(P<0.01),在高糖中加入不同浓度法舒地尔,MYPT1磷酸化水平较单纯高糖组明显下降(P<0.01)。结果提示:高糖能够激活ROCK通路,高渗透压对ROCK通路没有影响,法舒地尔可以阻断高糖诱导的ROCK通路过度激活。4高糖和法舒地尔对MAPKs通路的影响MAPKs主要包括ERK1/2、JNK和p38MAPK,各通路活性均以磷酸化水平表示。Western blot结果示:与对照组相比,高渗透压对ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平无明显影响(P>0.05),而高糖刺激显著地增加了ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平(P<0.01),在高糖中加入不同浓度法舒地尔,能显著地抑制高糖诱导的各分子磷酸化水平。结果提示:高糖能够激活MAPKs通路,MAPKs是ROCK的下游信号分子,高渗透压对MAPKs信号通路没有影响。结论:1高糖促进了肝星状细胞的增殖和转分化。2 Rho A/ROCK级联通路介导了高糖诱导的肝星状细胞增殖和转分化,MAPKs是ROCK的下游信号分子。