背景与目的:脑胶质瘤是颅内肿瘤中最常见的一型,占到颅内肿瘤的35%～51%。近几年来,虽然颅内肿瘤的诊疗手段不断提高,同时脑胶质瘤的分子、基因方面的研究也有了很大进展,但对恶性胶质瘤的治疗并没有重大突破,患者的预后欠佳,恶性胶质瘤患者大多数(约占77%)在确诊后1年内死亡。目前治疗脑胶质瘤的主要方法仍是以手术治疗、放射治疗、药物治疗等组成的综合治疗体系。因此,如何立足于现有的治疗技术,提高颅内肿瘤特别是脑胶质瘤的治疗效果,延长病人生存时间,提高病人的生活质量就成为当今神经外科亟待解决的难题。随着对肿瘤研究的不断深入,研究人员发现:在肿瘤的发生和发展过程中,仅有一小部分肿瘤细胞(即肿瘤干细胞)具有广泛的增殖和自我更新能力,而大多数肿瘤细胞从发生起始,就逐步进入分化、成熟甚至衰老阶段,缺乏或是渐渐失去增殖及自我更新的能力,仅有肿瘤形态学上的外在表现。继从白血病和乳腺癌中成功分离出具有干细胞特性的肿瘤细胞之后,脑胶质瘤干细胞的存在也得以确证。脑胶质瘤内存在有性质与神经干细胞相似的细胞,这些细胞在体外无血清培养基中可形成肿瘤球,具有自我更新、异常的增殖及多向分化潜能,且细胞比例与原肿瘤相似,可能参与了脑胶质瘤的形成。进一步研究发现:该类细胞阳性表达人类干细胞标志物CD133,可从实体胶质瘤中分离,即脑胶质瘤干细胞(braingiloma stem cell,BGSC)。将此类细胞以100个为量接种入NOD-SCID鼠脑,观察3-6个月后,可见鼠脑内长出新生肿瘤,且表型与亲代肿瘤相似。针对脑胶质瘤干细胞进行靶向治疗,为人脑胶质瘤的治疗方法提出了新的思路。现今治疗颅内肿瘤的常用手段是:在神经安全的前提下最大范围的切除肿瘤组织,并联合术后有效的放化疗。选择合适的、敏感性高的化疗药物可有助提高手术和放疗的效果,改善病人生活质量,延长生存期。近年来,个体化治疗成为肿瘤治疗的主导趋势,化疗前进行体外药敏试验排除无效药物,筛选敏感药物,并根据患者具体情况制定个体化的化疗方案,避免特异性不强的化疗药物给患者造成毒副作用,可最终达到提高临床化疗效果并节省医疗费用的目的。结合上述学说和临床实际,进行本实验设计。在脑胶质瘤中分离,培养及鉴定BGSC,选用替莫唑胺、雷帕霉素、亚砷酸、顺铂四种化疗药物,对脑胶质瘤干细胞进行体外药物敏感试验。替莫唑胺,一种治疗脑胶质瘤的新型口服化疗药物,是一种新型咪唑四嗪类,具有吸收完全,可通过血脑屏障,达血药峰浓度较快等优点;雷帕霉素,一种疗效好、低毒、无肾毒性的新型免疫抑制剂,主要用于治疗白血病,近期发现还具有抗肿瘤的作用;亚砷酸,是我国传统中药砒霜的主要成分,还未见有临床治疗脑胶质瘤的报道;顺铂,是临床一线化疗药物。通过观察各种药物对细胞生长抑制率变化情况,分析其对各药物敏感程度,进一步验证体外药敏试验对胶质瘤化疗的指导意义,为临床应用提供依据。材料与方法:在无菌条件下,手术中切除并通过病理检验证实的Ⅱ-Ⅳ级的胶质瘤标本,PBS充分冲洗后,经胶原酶及胰酶消化为单细胞悬液,以2×10~5个/ml浓度接种于含有生长因子的无血清培养基中培养。在相差倒置显微镜下观察其生长情况,并利用细胞免疫组化法检测Nestin和GFAP的表达,细胞免疫荧光法检测CD133的表达,流式细胞仪检测细胞周期。在鉴定所培养的细胞确为脑胶质瘤干细胞后,分别将替莫唑胺、雷帕霉素、亚砷酸及顺铂以不同浓度[血药峰浓度(μg/ml)ppc(plasma pleak concentration)](10ppc,5ppc,1.0ppc,0.5ppc,0.1ppc,0ppc),作用于体外培养的人脑胶质瘤干细胞,0ppc作为空白对照,用MTT法检测细胞生长抑制率,相差倒置显微镜观察细胞凋亡形态学变化,采用Caspase-3免疫组化试剂盒检测细胞凋亡,采用SPSS11.0统计软件对抑制率进行单因素的方差(One MayANOVA)分析,以检验各药物作用后对细胞生长的抑制率间差异有无统计学意义,利用最小显著差法(LSD)进行多重比较。结果:脑胶质瘤组织中确实存在脑胶质瘤干细胞,并能在体外分离、培养;将单细胞悬液种植在培养瓶中培养24～48h后可形成大小不一,折光性较强,悬浮生长的肿瘤干细胞球;培养4～5d后传代,可形成次代肿瘤干细胞球,且数量增多,体积增大,形状规则,肿瘤干细胞球和细胞形态与原代无异。免疫荧光化学染色CD133和免疫组织化学染色Nestin及GFAP阳性表达;用流式细胞仪对BGSC进行细胞周期分析,证实其具有干细胞的典型周期特性,即大部分细胞处于G0/G1期,只有少数细胞处于S期。脑胶质瘤干细胞在体外可进行诱导分化,在倒置相差显微镜下观察可见,细胞由周边开始向外侧分化生长,呈条梭状,形态似人脑胶质瘤细胞系。不同浓度的替莫唑胺、雷帕霉素、亚砷酸和顺铂对13例胶质瘤干细胞有其相应的不同抑制率。替莫唑胺,1ppc时,对BGSC作用72h和48h时的细胞增殖抑制率分别为(64.3±1.7)%和(24.1±2.4)%,72h的细胞抑制率升高明显,且差异有统计学意义(P＜0.01);雷帕霉素,1ppc时,对BGSC作用72h和48h时的细胞增殖抑制率分别为(37.8±0.4)%和(29.1±0.6)%,72h的细胞抑制率升高明显,且差异有统计学意义(P＜0.01);亚砷酸,1ppc时,对BGSC作用72h和48h时的细胞增殖抑制率分别为(62.6±3.0)%和(40.5±2.2)%,72h的细胞抑制率升高明显,且差异有统计学意义(P＜0.01);顺铂,1ppc时,对BGSC作用72h和48h时的细胞增殖抑制率分别为(63.5±1.3)和(32.7±1.7)%,72h的细胞抑制率升高明显,且差异有统计学意义(P＜0.01);随着药物浓度的增加和作用时间的延长,替莫唑胺、雷帕霉素、亚砷酸、顺铂四种化疗药物对BGSC增殖抑制率逐渐增高,呈时间-剂量效应。当药物浓度均为为1ppc时,作用24h后,亚砷酸对胶质瘤干细胞的抑制作用优于替莫唑胺及雷帕霉素,其差异有统计学意义(P＜0.05);当药物浓度均为为1ppc时,作用48h后,亚砷酸对胶质瘤干细胞的抑制作用优于替莫唑胺及雷帕霉素,其差异有统计学意义(P＜0.05),顺铂对胶质瘤干细胞的抑制作用优于替莫唑胺及雷帕霉素,其差异有统计学意义(P＜0.05);当药物浓度均为为1ppc时,作用72h后,替莫唑胺、亚砷酸及顺铂对胶质瘤干细胞的抑制作用优于雷帕霉素,其差异有统计学意义(P＜0.05)。替莫唑胺、雷帕霉素、亚砷酸及顺铂对13例标本中每1例的抑制率都不相同,且依据组织来源不同表现出个体化的差异。肿瘤干细胞经替莫唑胺、雷帕霉素、亚砷酸及顺铂处理后,其形态发生改变,大量细胞从聚集的细胞团周围分离开,散在于培养基中,其折光性减弱。利用免疫组化技术检测Caspase-3在用药后的细胞中的表达情况,可见有阳性表达,提示凋亡过程中有Caspase-3酶原蛋白的激活。结论:1.胶质瘤组织中可以分离出表达干细胞标记物CD133、Nestin的肿瘤干细胞,并可在体外进行培养,具有自我更新和克隆增殖的能力。2.替莫唑胺、雷帕霉素、亚砷酸及顺铂对不同来源的胶质瘤干细胞具有其相应的抑制率。上述4种药物对胶质瘤干细胞平均抑制率具有量-效与时-效关系,即随着药物浓度的增加及作用时间的延长,对细胞的抑制率增加。但不同药物在不同时间段对胶质瘤干细胞的抑制率不同。3.替莫唑胺、雷帕霉素、亚砷酸及顺铂对不同标本来源的胶质瘤干细胞即使在相同时间段相同浓度作用下,对其抑制率亦存在较大的个体化差异。4.替莫唑胺、雷帕霉素、亚砷酸及顺铂能不同程度抑制肿瘤干细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。凋亡过程中有Caspase-3酶原蛋白的激活。