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研究背景:心房颤动(Atrial fibrillation,AF)是临床上最常见的快速性心律失常,其致残致死率高,对人类健康危害极大。AF发生的病理生理基础主要包括结构重构、电重构及神经激素失调,其导致的异位电活动和折返路径形成是AF发生的主要基质,但其机制尚不明确。近年研究表明,成纤维细胞生长因子同源因子(fibroblast growth factor homologous factors,FHFs)参与心肌细胞离子通道电活动,提示FHFs功能障碍可能是导致心律失常发生的潜在靶点。FHFs是否通过调节心房肌细胞电活动参与调控AF易感基质形成值得进一步研究。第一部分心房颤动患者心房组织FHFs表达目的:观察AF患者FHFs各亚型的表达,筛选出差异表达最明显的FHFs。方法:1.收集于南昌大学第二附属医院心脏大血管外科行心脏二尖瓣置换手术的风湿性瓣膜病患者的右心耳组织,收集患者一般临床资料、既往病史、实验室检查结果及心脏彩超结果;根据患者是否合并房颤分为AF组和窦性心律(sinus rhythm,SR)组对患者临床资料进行分析。2.取患者部分心房组织提RNA,RT-PCR检测各型FHFs(FHF1、FHF2、FHF3、FHF4)mRNA表达水平。3.对患者各型FHFs mRNA水平与AF发生的重要影响因素左房内径(left atrial diameter,LAD进行相关性分析,筛选AF组与SR组FHF mRNA水平差异最明显且与LAD相关的FHF进行下一步实验。4.取患者部分心房组织,免疫组化、Western blot验证两组患者间前述筛选出的FHF表达情况。结果:1.共纳入20例病例,AF组14例,SR组6例。与SR组相比,AF组BNP、LAD明显升高,LVEF明显降低,且差异具有统计学意义。2.AF组心房组织FHF1、FHF4的mRNA水平均高于SR组,且差异具有统计学意义,而两组间FHF1的mRNA差异更为显著。两组间FHF2、FHF3的mRNA水平无明显差异。3.FHF1与LAD呈正相关(r=0.4778,P<0.05);FHF2、FHF3、FHF4与LAD无明显相关性。4.Western Blot和免疫组化结果显示AF组心房组织FHF1蛋白表达水平高于SR组,差异具有统计学意义。结论:1.风湿性二尖瓣疾病合并AF患者的心房组织中FHF1表达高于无AF的患者;2.FHF1 mRNA表达与LAD呈正相关;3.AF发生可能与FHF1有关。第二部分FHF1促心肌肥厚大鼠心房颤动发生的作用及机制目的:探讨FHF1在心肌肥厚大鼠AF易损基质形成的作用及机制。方法:(一)1.Sprague Dawley(SD)大鼠行主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction,TAC)手术构建心肌肥厚大鼠模型。2.SD大鼠分为2组:假手术Sham组,TAC组。体重(BW)、心脏重量(HW)、小动物超声心动图、Masson染色、血流动力学检测等数据收集,验证心肌肥厚模型构建成功。3.体表心电图采集;经过心外膜程序性电刺激,检测两组大鼠AF易感性。4.心房组织Masson染色、透射电镜观察两组大鼠心房组织病理学变化。5.Western Blot和免疫组化检测两组大鼠心房FHF1表达情况;心房组织免疫荧光和免疫共沉淀(Co-IP)检测FHF1与Na_V1.5之间的作用。(二)6.构建腺相关病毒注射病毒AAV9-FHF1 shRNA-GFP经尾静脉注射特异性感染大鼠心肌组织,Western Blot和荧光显像验证感染效果。7.构建心肌肥厚大鼠模型,TAC术2周后注射腺相关病毒。大鼠分组:A:Sham+vector组;B:TAC+vector组;D:TAC+AAV9-FHF1 shRNA-GFP组。8.各组大鼠经心外膜程序性电刺激,检测大鼠AF易感性9.各组大鼠通过全细胞膜片钳检测心房肌细胞动作电位(AP)及晚钠电流(INaL)。结果:(一)1.TAC术后8周,TAC组SD大鼠出现心肌肥厚,HW/BW升高。彩超结果显示:与Sham组相比,TAC组SD大鼠室间隔(IVS)厚度增加,左室后壁(LVPW)厚度增加(P<0.05,vs Sham组),E/A比值减低,差异均具有统计学意义。与Sham组相比,学流动力学检查结果:TAC组大鼠左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)明显升高,左室内压最大下降速率(-dP/dTmin)降低。Masson染色显示TAC组大鼠出现心室重构。2.心电图结果:与Sham组相比,TAC组大鼠RR间期缩短,心率增快,QT间期及QTc间期显著延长,差异具有统计学意义。3.两组大鼠AF可诱发性比较:PES后,TAC组大鼠AF诱发率及AF持续时间均高于Sham组,差异具有统计学意义。4.两组大鼠Masson染色检查,TAC组大鼠心房肌出现心肌重构;透射电镜显示TAC组大鼠心房肌闰盘结构改变。5.两组大鼠心房组织免疫组化和western blot检测显示TAC组大鼠FHF1表达高于Sham组。Co-IP结果显示TAC组大鼠心房组织中与FHF1结合的Na_V1.5高于Sham组。组织免疫荧光检测显示:FHF1与Na_V1.5共定位于细胞膜,TAC组大鼠心房肌细胞膜上FHF1与Na_V1.5共定位多于Sham组。(二)6.注射病毒后发现心房肌细胞中绿色荧光蛋白表达,western blot检测显示注射病毒AAV9-FHF1 shRNA-GFP组大鼠FHF1蛋白表达明显低于注射生理盐水及空载对照病毒vector组。7.大鼠分组:A:Sham+vector组;B:TAC+vector组;D:TAC+AAV9-FHF1shRNA-GFP组。心外膜PES刺激后,B组大鼠AF诱发率及AF持续时间高于A组;D组大鼠AF诱发率及AF持续时间低于B组。8.Co-IP结果显示B组大鼠心房组织中与FHF1结合的Na_V1.5高于A组,D组大鼠心房组织中与FHF1结合的Na_V1.5少于B组。9.B组大鼠心房肌细胞APD50、APD90大于A组,D组大鼠心房肌细胞APD50、APD90小于B组,差异具有统计学意义。B组大鼠心房肌细胞INaL大于A组;D组大鼠心房肌细胞INaL小于B组。结论:1、压力负荷过载致AF易感基质形成。2、FHF1可能通过与NaV1.5结合,增大心房肌细胞INaL,延长APD,促进心肌肥厚大鼠AF的发生。3、敲减FHF1可减小心房肌细胞晚钠电流INaL,缩短APD,抑制心肌肥厚大鼠AF发生。