研究目的:　　原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种常见的人类恶性肿瘤，发病机制极其复杂。从美国FDA批准的治疗HCC一线用药索拉非尼(Sorafenib，Sor)应用于临床以来，虽然对于延长HCC晚期患者的生存期和控制肝癌的恶化具有一定疗效，但是耐药现象和肿瘤对药物的敏感性降低也渐渐成为临床用药的问题。晚期肝癌患者逐渐对Sor用药产生耐药性，目前仍没有可替代的有效医治策略。因此，制定联合用药的治疗方案来克服这个难题，其中包括分子靶向药物的联合使用方案，对于HCC的临床治疗是非常必要的。贝沙罗汀(Bexarotene，Bex)是应用于皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma，CTCL)的临床治疗药物，它可以诱导肿瘤细胞凋亡，由于是维甲酸类似物，具有较低毒性，病人耐受性好，作为抗肿瘤药物的辅助用药具有良好的前景。本课题旨在探究Sor联合使用Bex对HCC细胞HepG2、SMMC-7721、PLC/PRF/5是否具有协同的抑制作用，从细胞的凋亡、增殖、血管拟态形成、侵袭和转移能力以及体内抗肿瘤效果方面进行实验，并初步探究了两种药物合用协同抗肿瘤作用的分子机制。　　研究方法:　　1.检测两种药物对HCC细胞的毒性作用　　采用MTT法、CCK-8法测定Sor和Bex单用及合用对HCC细胞HepG2、SMMC-7721、PLC/PRF/5的细胞增殖抑制作用，确定药物的IC50和两药合用产生协同抑制作用的最佳用药浓度。采用克隆形成实验检测Sor和Bex合用对HCC细胞生长增殖的长期效应，通过计数各组具备一定规模的克隆集落形成数量来判定药物对细胞增殖的影响。同时，检测了Sor和Bex对正常细胞HL-7702和HUVEC的毒性作用。通过PI单染色法流式细胞术测定在Sor和Bex作用下，HepG2的细胞周期分布情况。　　2.检测两种药物合用诱导HepG2细胞凋亡　　Sor和Bex合用作用于HepG2细胞48h，通过Hoechst33342染色法观察各组细胞的凋亡形态，通过细胞核的染色情况判定发生凋亡的细胞的大致数量。采用Annexin V-FITC/PI双染法通过流式细胞仪来定量检测HepG2细胞发生凋亡的比例。同时，采用Western blot方法检测各实验组凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax，caspase3，PARP，RXRα的水平。　　3.检测两种药物合用影响HepG2细胞血管拟态(vasculogenic mimicry，VM)形成的能力及HepG2细胞侵袭和迁移的能力　　采用VM形成实验检测Sor和Bex对HepG2细胞血管形成的抑制作用，通过计数小管形成数量来计算血管新生抑制率。采用划痕实验测定各加药组中HepG2细胞的迁移抑制率，Transwell实验测定各加药组中HepG2细胞的侵袭抑制率。采用Western blot实验测定Sor和Bex合用对MMP-9和MMP-2蛋白表达水平的影响。　　4.探讨两种药物协同抗HCC增殖的相关分子机制　　采用Western blot实验检测相关信号通路蛋白的表达水平，主要检测了EGFR/PI3K/Akt/mTOR/NF-κB,EGFR/VEGFR/STAT3/VEGFA,PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信号通路的蛋白分子表达。　　5.检测两种药物联用对裸鼠体内HCC移植瘤的生长抑制作用　　建立HepG2细胞的裸鼠移植瘤模型，连续灌胃给药24天(Sor30mg/kg，Bex40mg/kg)，通过测量瘤体积计算各组的肿瘤生长抑制率，给药结束后剖出瘤块测量瘤重，计算药物的抑瘤率，之后提取瘤组织蛋白，采用Western blot实验检测相关蛋白的表达水平，以确证药物的作用机制。　　研究结果:　　1.Sor和Bex合用产生协同抗HCC细胞体外生长的作用Sor和Bex单用时均起到抑制HepG2细胞在体外生长的作用。二者的IC50（μM）值分别为36.18±1.49，80.28±3.25。当两药采用不同浓度合用后，发现Sor12μM和Bex30μM时两药协同效应的增效倍数最高。同时，采用CCK-8法确证了Sor12μM和Bex30μM合用的协同增效倍数最高。对多种HCC细胞的毒性试验结果显示，两药合用对于HepG2和SMMC-7721细胞产生了协同抑制效应，其中对HepG2细胞的协同效应最为显著，对SMMC-7721细胞的协同效应不如HepG2细胞明显。然而，两药合用对PLC/PRF/5细胞没有协同抑制作用。克隆形成实验结果显示，Sor和Bex合用作用于HepG2细胞时，与对照组以及Sor和Bex单用组相比，抑制HepG2细胞的克隆形成能力明显增强，由Sor单用组抑制率47.65％和Bex单用组抑制率9.38％提高到合用组抑制率89.14％。二者合用对正常细胞的MTT毒性实验结果显示，在上述协同作用最明显的浓度下对人正常组织HUVEC和HL-7702细胞均未呈现明显的毒性和增殖抑制作用，说明Sor和Bex能够选择性的杀伤肿瘤细胞。细胞周期结果显示，Sor和Bex合用组与Bex单用组及对照组相比无统计学差异(P＞0.05)。　　2.Sor和Bex合用对HCC细胞凋亡的影响　　Hoechst染色实验结果显示，空白对照组细胞核呈饱满椭圆形，染色质均匀着色，而各加药组Hochest染色观察到不规则的细胞核形态，凋亡小体可见，出现明显的细胞凋亡形态，两药合用组的凋亡细胞数量明显高于单用Sor或者Bex组。Annexin V-FITC/PI双染法实验结果显示，Bex（30μM）合用Sor（12μM）引起的凋亡细胞的比例显著高于单药组和对照组，从Sor单药组凋亡率12.64％提高到两药合用组凋亡率21.93％。Western blot实验结果显示，Bex单用时可引起HepG2细胞中Caspase3和cleaved PARP表达上调以及核受体RXRα表达下调水平，两药合用后Caspase3和cleaved PARP蛋白水平比单用Sor组及对照组均明显升高，RXRα蛋白水平则降低，同时Bax/Bcl-2比率比对照组和Sor单用组也明显升高，说明Bex通过激活caspase3，增加cleaved PARP蛋白水平，同时Sor上调了Bax/Bcl-2比率，从而引发了协同促进HepG2细胞调亡的效应。　　3.Sor和Bex合用对HepG2细胞VM形成及侵袭和迁移的影响　　VM形成实验结果显示，单药组中完整的小管拟态形成数明显比对照组减少，而两药联用组的细胞基本没有形成完整的小管结构，细胞散在地分布在基质胶中，拟态血管形成抑制率从单用Sor组的67.39％增加到两药联用组的93.48％，表明Bex增强了Sor对HepG2细胞VM形成的抑制作用。　　划痕实验结果显示，Sor和Bex合用组比Sor单药组更加明显地抑制了HepG2细胞的迁移，迁移抑制率在48h时从单用Sor组的87.6％增加到合用组的97.97％。由此可见，Bex能够增强Sor抑制HepG2细胞迁移的能力。Transwell实验结果显示，Bex（30μM）单药组与空白组和Sor（12μM）单药组相比，侵袭能力显著降低，两药合用组与Sor单药组相比，侵袭能力也显著降低。Western blot实验结果显示，Bex单药（30μM）组与对照组和Sor单药(12μM)组相比，MMP-2和MMP-9的表达水平显著下降，并且合用组这两种蛋白水平也比对照组和Sor单药组降低，说明Sor和Bex合用通过降低MMP-2和MMP-9蛋白表达来抑制HepG2细胞的侵袭能力。　　研究结论:　　1.Bex可增强HepG2或SMMC-7721细胞对Sor的敏感性，并且两药合用在HepG2细胞中的协同作用比SMMC-7721细胞更显著。同时发现，Sor和Bex合用对人正常组织HL-7702细胞和HUVEC产生较弱的细胞毒性。　　2.Sor和Bex的协同抗增殖作用与抑制EGFR/PI3K/Akt/mTOR/NF-κB生存途径相关，协同诱发凋亡的作用与Bax/Bcl-2及Caspase凋亡途径相关，但二者合用并未影响细胞周期的进程。　　3.Sor和Bex合用通过抑制EGFR/VEGFR/S TAT3/VEGFA途径并下调MMP-2和MMP-9，产生协同抗血管生成和抑制迁移侵袭作用。　　4.Bex通过抑制PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路提高了HepG2细胞对Sor的敏感性，并抑制了细胞增殖。　　5.小鼠体内实验证实两药合用可协同抑制移植瘤生长，且无明显的毒性反用。同时，两药对肿瘤组织内的相关信号通路的调节作用与体外细胞实验一致。