目的：L1属于长散布重复序列(long interspersed nuclear elements 1)，Alu属于短散布重复序列(short interspersed nuclear elements)，L1重复序列和Alu分别占据了人类基因组的16.9％和9.9％，两者是人类基因组中最主要的重复序列。在容易失活的基因、等位排斥基因及其侧翼存在较多的L1序列，如免疫细胞的B细胞受体基因，T细胞受体基因，细胞因子中的白介素2基因等。L1和Alu的非随机性分布反映它们的功能。近年来的研究表明重复序列与多种生物学现象有关，包括基因转座，基因突变，X染色体失活，等位基因排斥，基因重排，肿瘤发生，自身免疫病，生物进化等。真核生物基因包括增强子、启动子、外显子、内含子、多聚腺苷酸加尾信号。SV40PolyA(Simian Virus40 Polyadenylation Signal，PolyA)是猴巨细胞病毒早期蛋白多聚腺苷酸加尾序列(240bp)，含有SV40早期蛋白加尾信号，是一种强的真核细胞转录终止序列。一般认为PolyA位置下游序列与其上游序列不再属于同一基因，而属于基因侧翼序列。 有人证明L1.2 ORF2插入GFP基因下游，反序表达高于正序。本文拟用L1重复序列另一家族L1PA3 ORF2观察正、反序列是否有类似L1.2影响基因表达的特征。将Alu和ORF2片段串联后按正、反方向插入pEGFP-Cl质粒GFP基因下游，观察对GFP基因的影响。将PolyA正、反和改变TAA终止密码子的PolyAm正、反序列插入GFP基因下游ORF2正、反序列上游，观察ORF2作为侧翼序列对GFP基因的影响。方法：1串联表达载体的构建合成上游带EcoR I、Xba I，下游带Kpn I、Nhe I酶切位点的引物，见引物一览表(Table 1)，利用Xba I和Nhe I酶切粘端可以连接但不能切断的特性，将插入pEGFP-C1质粒的280-1片段反复重复制备成串联表达载体。 2.PolyA表达载体的构建用带有Pst I酶切位点的引物扩增pEGFP-C1质粒上的PolyA序列(240bp)，用Pst I单酶切PolyA PCR产物和C1-ORF2A/C1-ORF2Aas载体，见表达载体一览表(Table 2)，酶切后的载体用碱磷酶处理，经连接、PCR、酶切筛选后获得PolyA正、反方向插入表达载体。 3.细胞转染将构建好的质粒用LipofectamineTM2000瞬时转染HeLa细胞，37℃、5％CO2环境培养36小时。 4 Northern杂交质粒转染HeLa细胞后，用Trizol一步法提取总RNA，经甲醛变性凝胶电泳后，将RNA转移到尼龙膜上，α-32P标记的GFP探针杂交、放射自显影以后，尼龙膜用剥离液处理，冲洗后用检测neo(neomycin resistancecassette)RNA的探针再次杂交，放射自显影作为对照。 5荧光阳性细胞计数质粒转染HeLa细胞后，×100倍视野白光下计数细胞总数，同样视野紫兰光下计数荧光阳性细胞数，计数细胞总数至少500个，计算荧光细胞阳性率。 结果：1表达载体鉴定C1-280-1*14，C1-280-1*14as和PolyA表达载体的酶切电泳结果见Fig.2，Fig.4。片段大小及酶切位点符合质粒设计。用C1-280-1*2和C1-PolyAas-ORF2Aas进行测序，符合参照序列(Fig.3，Fig.5)。 2 ORF2插入表达载体Northern检测Xho Ⅰ、Pst Ⅰ双酶切及Apa Ⅰ单酶切制备的ORF2正、反表达载体 (Cl-ORF2，C1-ORF2as，C1-ORF2A和C1-ORF2Aas)及LacZ插入表达载体(C1-LacZ和C1-LacZas)瞬时转染HeLa细胞，提取总RNA，用Northern杂交检测GFP基因RNA的表达量及长度(Fig.6A，B)。发现ORF2反序插入质粒的GFP基因转录水平均高于正序，C1-ORF2as与C1-ORF2， C1-ORF2Aas与C1-ORF2A的GFP基因RNA相对表达量的比值分别为69 1.4/24.7(28.0倍)和582.6/24.1(24.2倍)C1-LacZ正、反转录水平没有显著区别，C1-LacZas与C1-LacZ的GFP基因RNA相对表达量的比值为256.9/252.8(1.0倍)。pEGFP-Cl的GFP基因RNA的相对表达量为1333.4，高于其它泳道表达量。 ORF2正、反表达载体均发生转录提前终止，C1-LacZas也发生转录提前终止，但C1-LacZ不发生转录提前终止。ORF2插入表达载体的荧光检测已另文报道。 3.串联表达载体检测3.1串联表达载体Northern检测检测结果见Fig.7A，B。同等长度的Alu正序插入质粒的GFP基因转录水平高于反序，C1-Alu8与C1-Alu8as，C1-Alu14与C1-Alu14as的GFP基因RNA相对表达量的比值分别为317.2/67.1(4.7倍)和48.9/8.6(5.7倍)。相反，同等长度的C1-280-1反序转录水平高于正序， C1-280-1*8as与C1-280-1*8，Cl-280-1*14as与C1-280-1*14的GFP基因RNA相对表达量的比值分别为523.3/121.5(4-3倍)和3 14.9/87.7(3.6倍)。不同长度的同种序列均是8串联体转录水平高于14串联体。 Alu正序不发生转录提前终止，而C1-280-1串联体均发生转录提前终止。 3.2串联表达载体荧光检测荧光图见Fig.8A，B。荧光阳性细胞百分数见Table 3。Alu8正向插入质粒荧光阳性率高于Alu8反向插入；280.1*8反向插入质粒荧光阳性率高于280-1*8正向插入；280-1*14正向和Alu*14正、反插入对GFP基因表达均发生强烈抑制。 4 PolyA表达载体检测4.1 PolyA表达载体Northern检测PolyA正、反和改变TAA终止密码子的PolyAm正、反插入GFP基因下游ORF2正、反序列上游，制备的表达载体Northern检测结果见Fig.9A，B。PolyA插入反序转录水平均高于正序，2，4，6，8泳道的GFP基因相对表达量分别高于1，3，5，7泳道。 不管PolyA的正、反序列，所有插入PolyA的质粒均发生转录提前终止(Fig.9A)。 4.2 PolyA表达载体荧光检测荧光图见Fig.10A，B。荧光阳性细胞百分数见Table 3。在C1-ORF2A和Cl-ORF2Aas质粒的ORF2上游分别插入正、反PolyA， C1-PolyAas-ORF2A荧光阳性率高于C1-PolyA-ORF2A，C1-PolyAas-ORF2Aas荧光阳性率高于C1-PolyA-ORF2Aas，说明ORF2不变时PolyA反序荧光阳性率高于正序；Cl-PolyA-ORF2Aas荧光阳性率高于Cl-PolyA-ORF2A，Cl-PolyAas-ORF2Aas荧光阳性率高于Cl-PolyAas-ORF2A。说明PolyA不变时ORF2反序荧光阳性率高于正序，与Northern结果一致。PolyAm正序显著降低荧光阳性细胞比率，PolyAm反序也降低荧光阳性细胞比率，但是程度较轻。结论：1 ORF2正序对GFP报告基因的抑制作用强于反序。 2.Alu和280-1片段插入pEGFP-Cl质粒GFP基因下游均呈长度依赖性抑制GFP基因表达，Alu属于转录延伸序列，不发生转录终止，280-1片段属于转录终止性序列。 3.SV40 PolyA正、反序列插入GFP基因下游ORF2上游时，均能解除ORF2对GFP基因的抑制，PolyA反序的解除抑制作用强于正序。PolyA改变终止密码子读码框后对GFP基因的RNA表达量不产生影响，但是GFP荧光阳性细胞数显著下降。