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目的:应用基因融合技术,构建含有增强绿色荧光蛋白基因和突触受体相关蛋白、肌肉特异性受体酪氨酸激酶重组融合基因的真核表达载体pEGFP-N1/Rapsyn/MuSK。
方法:
1、通过高保真PCR法,以pcDNA-Rapsyn为模板获得Rapsyn目的基因,凝胶回收后用限制性内切酶双酶切法将目的基因连接至真核表达载体pEGFP-N1,并转化XL1-Blue感受态细胞。然后用NheI和XhoI双酶切筛选阳性单克隆重组子,获得预期结果后进行序列测定、序列比对。
2、通过高保真PCR法,以pcDNA-MuSK为模板获得MuSK目的基因,凝胶回收后用限制性内切酶双酶切法将目的基因连接至真核表达载体pEGFP-N1,并转化XL1-Blue感受态细胞。然后用XhoI和EcoRI双酶切筛选阳性单克隆重组子,获得预期结果后进行序列测定、序列比对。
3、用NheI和XhoI分别双酶切测序正确的pEGFP-N1/Rapsyn和pEGFP-N1/MuSK,凝胶回收Rapsyn基因片段和线性pEGFP-N1/MuSK并连接,转化XL1-Blue感受态细胞后,用NheI和EcoRI双酶切筛选阳性单克隆重组子,获得预期结果后进行序列测定、序列比对。
结果:
1、通过高保真PCR法以pcDNA-Rapsyn为模板扩增出了1252bp的DNA片段,构建筛选的阳性重组质粒经双酶切得到在MarK1200bp附近的DNA片段,大小与预期结果相符,测序结果与目的基因Rapsyn序列(已测序并BLAST)通过Vector NTISuite8软件比对后一致。
2、通过高保真PCR法以pcDNA-MuSK为模板扩增出了2657bp的DNA片段,构建筛选的阳性重组质粒经双酶切得到在Mark2000bp和3000bp之间的DNA片段,大小与预期结果相符,测序结果与目的基因MuSK序列(己测序并BLAST)通过Vectot NTI Suite8软件比对后一致。
3、构建筛选的阳性重组质粒“pEGFP-N1/Rapsyn/MuSK”经限制性内切酶双酶切得到在Mark3000bp和4000bp之间的片段,大小与预期结果相符(Rapsyn/MuSK融合基因分子量为3899bp),测序序列与目的基因Rapsyn/MuSK序列通过VectorNTI suite8软件比对后一致。
结论:通过基因融合技术成功构建了重组增强绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1/Rapsyn/MuSK。