论文部分内容阅读
目的: ADMA是心血管疾病的风险因素，其主要代谢酶DDAH1被认为是心血管疾病治疗的重要靶点。本课题组的前期研究发现人类DDAH1存在3个转录本，但只有其中DDAH1-V1与ADMA代谢相关。本文旨在研究辛伐他汀对DDAH1的三个不同转录mRNA表达的影响及其机制，为探讨DDAH1不同转录本在辛伐他汀反应性及不同转录本的功能奠定基础。 方法: (1) Transwell小室实验测定辛伐他汀对ADMA处理的脐静脉内皮细胞迁移的影响:细胞分为DMSO（对照）组、ADMA(3μM)处理组、ADMA（3μM）+辛伐他汀(1μM)处理组和辛伐他汀(1μM)处理组。细胞应用DMSO（对照组）或ADMA(3μM)处理24h，ADMA(3μM)+辛伐他汀（1μM）处理组和辛伐他汀（1μM）处理组先用1μM辛伐他汀预处理6h，将细胞转移至Transwell小室上室，24h后测定小室对侧迁移的细胞数目，以评估内皮细胞迁移能力。 (2)观察辛伐他汀对原代人脐静脉内皮细胞DDAH1转录本表达的影响:原代培养的脐静脉内皮细胞分别应用DMSO(溶剂对照组)或低、中、高浓度(0.2μM、1μM、2μM)的辛伐他汀处理12h和24h，提取总RNA和总蛋白，采用Real-time PCR的方法检测DDAH1的三个转录本mRNA表达，western-blot检测DDAH1-V1蛋白表达。 (3)观察辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞DDAH1转录本mRNA稳定型的影响:人类脐静脉内皮细胞株分别加用（处理组）或不加（对照组）辛伐他汀（1μM、2μM）预处理2h后，加入放线菌素D(ActD，2.5μg/ml）进行处理，并在加入ActD后0h、1h、2h、4h、8h和12h收集细胞，提取总RNA，采用Real-time PCR法检测DDAH1的三个转录本mRNA的表达。 结果: (1)与对照组相比，3μM ADMA处理可显著促进内皮细胞迁移（1.30±0.30 vs1±0.00，P=0.012），中浓度的辛伐他汀单独处理对内皮细胞迁移无显著影响。与ADMA处理组相比较，中浓度辛伐他汀+ADMA组细胞迁移比显著下降（0.94±0.086 vs1.30±0.30，P=0.011）。 (2)与DMSO组相比，低、中、高浓度的辛伐他汀对DDAH1转录本1(DDAH1-V1)mRNA表达均无显著影响;中、高浓度的辛伐他汀呈浓度依赖性地下调DDAH1转本2(DDAH1-V2)mRNA表达(0.52±0.24 vs0.89±0.23，P=0.044和0.38±0.19 vs0.89±0.23，P=0.0093)和转录本3(DDAH1-V3)的mRNA表达（0.59±0.19 vs0.86±0.05，P=0.028和0.40±0.15 vs0.86±0.05，P=0.0013）。 (3)与DMSO相比，低、中、高三个浓度的辛伐他汀处理12h呈浓度依赖性地上调内皮细胞内DDAH1-V1蛋白表达（低浓度:1.35±0.16 vs1±0.00，P=0.03;中浓度:1.90±0.29 vs1±0.00，P=0.00014;高浓度:1.95±0.04 vs1±0.00，P=0.0001）。低、中浓度辛伐他汀有上调DDAH1蛋白表达的趋势，但未达到显著地统计学意义;高浓度辛伐他汀处理24h可显著上调DDAH1-V1蛋白表达(2.11±0.55 vs1±0.00，P=0.0097)。 (4)与DMSO组相应时间点相比较，2.5μg/ml ActD在1～12h内具有升高DDAH1-V1 mRNA△CT（CTDDAH1转录本-CTGAPDH）的趋势，且在处理后1h时达到统计学差异（5.63±0.64 vs4.64±0.37，P=0.011）。与ActD相应时间点相比，1μM Sim+ActD处理组1～4hDDAH1-V1 mRNA△CT值出现降低的趋势，但仅1h和2h出现显著下降（1h:4.66±0.27 vs5.63±0.64,P=0.0085;2h:3.53±0.60 vs5.89±0.15，P=0.021）;2μM Sim+ActD处理组1～8h DDAH1-V1 mRNA△CT值有下降的趋势，仅1h时具有显著的差异(4.36±0.17 vs5.63±0.64,P=0.0040)。 (5)与DMSO相比，ActD在8～12h有升高DDAH1-V2 mRNA△CT的趋势，且在8h达到显著地统计学差异（8.06±0.49 vs7.21±0.15，P=0.012）;与ActD2.5μg/ml相比，Sim1μM+ActD和Sim2μM+ActD处理对DDAH1-V2 mRNA的△CT值无显著影响。 (6)与DMSO相比，2.5μg/ml ActD处理2～12h DDAH1-V3 mRNA的△CT有升高的趋势，但无显著地统计学差异。与ActD2.5μg/ml处理组相比，Sim1μM+ActD处理和Sim2μM+ActD处理对DDAH1-V3mRNA的△CT无显著影响。 结论: (1)病理生理浓度的ADMA可促进原代培养的HUVECs细胞迁移，该作用可被辛伐他汀所逆转。 (2)原代培养的HUVECs在辛伐他汀作用下，DDAH1-V2和DDAH1-V3 mRNA表达显著下降，而DDAH1-V1 mRNA的表达相对稳定，DDAH1-V1蛋白表达上调。 (3)辛伐他汀上调DDAH1-V1蛋白表达的机制可能与增加DDAH1-V1 mRNA的稳定性有关。