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D-乳酸脱氢酶(EC1.1.1.28)在粘质沙雷氏菌(Smarcescens H3010)发酵中的作用主要是将丙酮酸转化为D-乳酸,D-乳酸作为一个手性中心,是合成多种手性物质的前体,在医药、农药、化工等方面的应用十分广泛。
本实验室通过构建S.marcescens H3010的基因组文库,再经功能性验证得到一个新的D-乳酸脱氢酶基因。本课题从S.marcescens H3010的基因组DNA中克隆到该D-乳酸脱氢酶基因,包含开放阅读框(ORF)993bp,编码330个氨基酸,并将此ORF序列与NCBI Blastn(http:／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／)数据库基因进行同源比对,发现与Serratia proteamaculans568的同源性高达93.3％,因此可初步认为获得的是一个新的D-乳酸脱氢酶基因,经生物信息学分析,推测该分子中含有18个S原子,由12个β-折叠和13个α-螺旋组成,该酶分子量为36466.8 Da,理论等电点pI为5.55。
利用pET28a(+)表达系统,成功的在E.coli BL21DE3)中实现了对D-乳酸脱氢酶的高效表达,并且通过优化诱导表达条件,得到了大部分以可溶性形式存在的D-乳酸脱氢酶,构建的表达质粒pET-ldh的N末端有6个组氨酸(His6)融合标记,因此可选择Ni柱亲和层析的方法进行分离纯化,经过优化分离纯化的条件,最后得到纯度高达89.5％的D-乳酸脱氢酶(D-LDH),酶活为322.9 U／mg(测定条件为37°C,pH7.0)。
测定酶的热稳定性发现,D-乳酸脱氢酶在高于50°C的环境里极易失活,而测反应最适温度为60°C(反应30s内)。该酶在pH7.0左右最为稳定,而反应最适pH为7.5。二价金属阳离子Zn2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Ba2+、Ni2+对酶均有抑制作用,Zn2+和Ba2+抑制作用最弱,Cu2+和Fe2+的抑制作用最强。动力学研究显示,底物丙酮酸浓度超过30 mmol／L时对酶的抑制作用逐渐增强,而辅酶NADH浓度高于0.5 mmol／L时对酶具有很强的抑制作用,当其浓度达到1mmol／L时酶的表观活力变为0。D-乳酸脱氢酶对底物丙酮酸的Km=3.39 mmolL-1,对辅酶NADH的Km=1.43 mmol L-1,D乳酸脱氢酶对辅酶NADH的亲和力大于对底物丙酮酸的亲和力。通过HPLC成功检测到异源表达的D-LDH催化底物丙酮酸(pyruvate)生成手性产物D-乳酸。此酶为S.marcescens H3010发酵中转化丙酮酸为D-乳酸的酶。