棉花是我国的重要经济作物,在国民经济中具有重要作用。棉花纤维是重要的天然纤维来源。棉纤维细胞是由胚珠外珠被表皮细胞经快速突起和急速伸长而形成的单细胞,具有极度伸长的细胞形态。其生长发育经历了起始期、快速伸长期、成熟期和脱水期,是研究植物细胞发育的理想材料。同时,纤维细胞的发育过程也是棉花纤维产量和品质的形成过程,研究纤维细胞的发育及其调控机理是解析棉花纤维产量和品质(长度和细度等)形成机理的重要环节,将为进一步培育高产优质棉花提供理论基础。近年来对棉花纤维发育的研究取得了一定进展,但目前调控棉纤维发育的分子机制仍不清楚。鞘脂(sphingolipids)是含有长链鞘样碱基骨架的一类结构复杂的脂类分子,种类繁多,广泛存在于生物膜结构中。鞘脂及其衍生物是许多细胞活动进程中重要的动力调节器,参与了许多重要的信号转导过程,不同种类的鞘脂存在于不同组织中,甚至是不同组织的不同细胞类型中,目前对植物中鞘脂的研究甚少。在棉纤维细胞极性伸长过程中,生物膜系统的面积极度扩张,务必需要不同鞘脂分子的相应增加,以满足各种生理生化活动所需,从而协调完成伸长过程。因此鞘脂的正常合成在纤维细胞生长发育中可能发挥了重要作用。为了研究鞘脂在棉花纤维细胞生长发育中的作用,首先克隆了棉花中3-酮基二氢鞘氨醇还原酶基因的同源基因Gh KDSR2s,然后构建反义表达载体并进行棉花的遗传转化,探索了下调Gh KDSR2-1对棉花植株和纤维生长发育的影响,主要结果如下:1.Gh KDSR2s基因的克隆和序列分析以陆地棉徐州142野生型10dpa的纤维c DNA为模板,扩增得到2个同源的Gh KDSR2基因。其中克隆到的Gh KDSR2-1的c DNA序列包含一个996bp的ORF,推导的ORF编码331个氨基酸残基,分子量36.0k D,IP=8.065。克隆到的Gh KDSR2-2的c DNA序列包含一个999bp的ORF,推导的ORF编码332个氨基酸残基,分子量36.2k D,IP=7.436。Gh KDSR2与拟南芥、可可、蓖麻等物种的3-酮基二氢鞘氨醇还原酶基因具有较高的同源性。这些分析结果说明我们克隆得到的序列是棉花3-酮基二氢鞘氨醇还原酶基因的同源基因。2.Gh KDSR2-1基因的表达特性为了明确克隆得到的两个Gh KDSR2基因表达特性,利用实时定量RT-PCR分别检测了其在野生型棉花的不同组织器官、纤维和胚珠不同发育时期,以及纤维突变体的几个重要时期的表达水平。结果表明,Gh KDSR2在检测样品中均有表达,但其表达水平存在明显差异。在纤维发育过程中其表达峰值出现在快速伸长期,说明Gh KDSR2基因与纤维细胞伸长有一定关系;进一步检测了该基因在纤维发育突变体中的表达差异,结果表明在徐州142无绒无絮突变体的纤维起始期和超短纤维突变体的纤维快速伸长期,Gh KDSR2的表达相较于野生型都有明显下降,说明Gh KDSR2在纤维的起始和伸长阶段可能发挥了重要作用。3.反义抑制Gh KDSR2-1对棉花植株生长发育的影响利用Gh KDSR2序列构建反义抑制植物表达载体,并进行棉花的遗传转化。通过GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定获得7个阳性转化子。对转基因棉花的性状变异进行观测和统计,结果显示下调Gh KDSR2导致了植株矮小纤细,生长缓慢,难以成活;花小,花粉少且严重败育,因此难以稳果;棉桃变小,发育缓慢,且每个棉桃中仅有1-2粒种子发育成熟;叶片变小、颜色变深且表面粗糙。随后进一步对叶片中叶绿素和木质素含量进行检测,发现其叶绿素和木质素含量升高,木质素分布区域增多。结果表明,抑制Gh KDSR2-1表达,棉花植株生长发育受到严重干扰。4.反义抑制Gh KDSR2-1对棉花纤维细胞生长发育的影响为了明确Gh KDSR2-1对棉花纤维细胞生长发育的影响,首先采用棉花胚珠离体培养方法,检测了转基因纤维细胞的生长发育变化,结果发现抑制Gh KDSR2-1的表达明显抑制纤维细胞的伸长,此结果与FB2(鞘脂合成抑制剂)处理野生型纤维的结果一致,说明植物鞘脂的正常合成在纤维细胞伸长中具有重要作用。转基因成熟纤维的测量结果表明,抑制Gh KDSR2-1的转基因纤维长度明显降低,与对照相比,转基因纤维长度降低了18.4%。该结果进一步说明Gh KDSR2基因在纤维伸长中有着重要作用。扫描电镜观察的结果表明,转基因纤维细胞的起始受到抑制,起始数量明显减少。这些结果证明下调Gh KDSR2-1抑制了纤维了起始和伸长,说明Gh KDSR2在纤维起始和伸长过程中发挥了重要作用。5.下调Gh KDSR2-1抑制棉花种子中脂类合成,提高蛋白质含量反义抑制Gh KDSR2-1棉花种子中脂类含量较野生型降低了2.6%左右,其中C18-0变化最为明显,下降了约9.2%,而其蛋白含量较野生型升高了13.7%左右,说明下调Gh KDSR2-1抑制棉花种子中脂类合成,提高蛋白质含量。