随着人口老龄化的加剧,脑血管疾病的发病率明显上升,而且发病趋势有逐渐年轻化的迹象。缺血性神经元损伤是威胁人类健康的重要原因之一,但目前仍缺乏切实有效的防治措施。不同于其他组织细胞,神经元更容易因受到各种有害刺激而死亡。海马是与空间学习记忆功能密切相关的一个重要的脑区,其中CA1区锥体神经元对缺氧、缺血特别敏感,受到的损伤也最为严重,而且成年大脑海马CA1区的再生能力非常低。因此,如何预防和保护缺血性神经元损伤一直是脑卒中、脑创伤等疾病的主要治疗策略。白藜芦醇(Resveratrol,Res),非黄酮类多酚化合物,化学名称为3,4,5-三羟基二苯乙烯,在虎杖、葡萄、黎芦、决明、花生等植物中含量较为丰富。研究表明,Res能抑制N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体介导的Ca2+内流,促进突触的形成及突触的生长。目前普遍认为,缺血性脑损伤时神经元死亡可因NMDA受体过度激活引起,推测Res有可能是通过调控脑缺血引起的由NMDA受体介导的细胞内钙超载,阻断凋亡信号的转导。作为经典的MAPK信号转导途径,ERK1/2信号通路激活后,能明显抑制因脑缺血/再灌注损伤的NMDA受体活性,减少Ca2+内流,进而对缺血神经元发挥保护作用。CREB是受ERK1/2调节的一种重要的核转录因子,在神经系统中发挥着十分重要的作用,激活CREB可促进神经元的存活,而抑制CREB则促进神经元的凋亡。大量研究表明,磷酸化肌醇磷脂3位羟基的激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)和其主要下游靶目标Akt共同构成一条重要的PI3K-Akt抗凋亡信号转导通路,很多神经营养因子、中药均能通过激活PI3K-Akt信号通路发挥神经保护作用。缺血性脑损伤亦有凋亡相关基因Bcl-2、Bax的参与,Bcl-2与Bax的比值能决定细胞是否凋亡。虽然目前已有文献报道了Res对缺血性脑损伤具有保护作用,但有关Res对缺血再灌注脑损伤预防和保护作用的有效时间窗以及Res作用的具体分子机制目前鲜有报道。本研究分以下两部分来阐明Res对缺血诱导的神经元损伤的调控作用:(1)NMDA受体介导的ERK1/2-CREB信号转导通路在Res预处理对大鼠缺血性海马CA1区神经元损伤保护中的作用;(2)Res慢性给药对脑缺血再灌注后海马区pAkt及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响。通过本课题的研究,可以为缺血性脑损伤的药物治疗提供新的靶点,为临床治疗提供一定的理论依据。1.白藜芦醇预处理通过ERK1/2-CREB信号转导通路,阻止局灶性脑缺血/再灌注诱导的大鼠海马CA1区神经元损伤在本研究中我们发现,(1)90 min MCAO引起大鼠缺血侧脑梗死体积及海马CA1区锥体神经元死亡数量显著增加;在缺血前1 h、4 h进行Res(30 mg/kg)预处理明显缩小了脑梗死体积,海马CA1区锥体神经元死亡数量亦明显降低;(2)90 min MCAO导致大鼠空间学习记忆功能减退,逃避潜伏期明显延长;在缺血前1 h、4 h进行Res预处理,均明显改善了大鼠的空间学习记忆功能;(3)探讨在脑缺血前30 min侧脑室注射MK-801(NMDA受体阻断剂)对Res作用的影响。结果显示,在MCAO前30 min侧脑室注射MK-801,能明显减少缺血引起的海马CA1区神经元死亡;对于在缺血前1 h Res预处理的大鼠,Res给药前30 min侧脑室注射MK801,阻断了Res的神经保护作用;而对于在缺血前24 h进行Res预处理的大鼠,Res给药前30 min侧脑室注射MK801则无效;(4)进一步探讨对于在缺血前1 h或24 h进行Res预处理的大鼠,在Res给药前30 min侧脑室注射U0126(ERK1/2抑制剂)对Res作用的影响。结果显示,在缺血前30 min侧脑室注射U0126,加重了缺血导致的海马CA1区神经元死亡;对于在缺血前1 h进行Res预处理的大鼠,侧脑室注射U0126阻断了Res的神经保护作用,而对于在MCAO前24 h进行Res预处理的大鼠,U0126则无效;(5)在缺血再灌注第5天,与MCAO组相比,在缺血前1 h进行Res预处理使缺血侧海马CA1区pERK1/2及pCREB的表达明显增加,而在Res给药前30 min侧脑室注射U0126则降低了pERK1/2及pCREB的表达。提示ERK1/2-CREB信号转导通路参与了Res对缺血性脑损伤的神经保护作用。2.再灌注后白藜芦醇慢性给药通过上调海马pAkt及Bcl-2的表达、下调Bax的表达减轻缺血性脑损伤本研究中继续使用90 min MCAO法制备局灶性脑缺血大鼠模型,从缺血再灌注3 h后开始连续4 d对大鼠腹腔注射Res(30 mg/kg),(1)HE染色结果显示,90 min MCAO导致海马CA1区大约82%的神经元死亡,Res慢性给药能明显减少MCAO引起的海马CA1区神经元死亡;TUNEL染色结果显示,MCAO导致海马CA1区大约87%的神经元凋亡,Res慢性给药使海马CA1区神经元凋亡数量明显减少;(2)90 min MCAO导致海马CA1区LTP诱导障碍,Res慢性给药可以恢复LTP的诱导;(3)局灶性脑缺血导致海马CA3-CA1区基础的突触传递功能障碍,但是突触前的功能没有受到影响。Res慢性给药可以改善脑缺血所致的突触传递功能障碍;(4)Western blot结果显示Res慢性给药使Res+MCAO组大鼠海马区pAkt表达明显升高,但对Res+Sham组大鼠pAkt的表达没有明显影响;(5)与Sham组相比,MCAO组大鼠海马区Bcl-2表达下降、Bax表达升高,Bcl-2/Bax比值下降;而Res慢性给药使Res+MCAO组大鼠海马区Bcl-2表达上调、Bax表达下调,Bcl-2/Bax比值增加。结论:本研究发现,在缺血前1 h Res预处理通过激活NMDA受体介导的ERK1/2-CREB信号转导通路阻止海马CA1区神经元损伤;在缺血后的一定时间内进行慢性Res给药通过上调pAkt、Bcl-2的表达、下调Bax的表达,对海马CA1区神经元发挥保护作用。