嗜吞噬细胞无形体(Anaplasmaphagocytophilum,AP)是一种新发的人畜共患病病原体,主要经蜱传播,其宿主谱十分广泛,包括人、家畜、野生动物。该病原感染人体引起的人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA),可出现从发热到死亡不同程度的临床表现。AP目前已成为全球范围内一种危害公共健康的重要虫媒传染病原。云南省位于中国的西南边陲,地理气候条件复杂,独特的自然条件造就省内有害微生物和有害昆虫媒介种类多且密度大,加上各类宿主动物广泛分布,使云南省成为各类虫媒传染病的高发地区。蜱在云南省分布广泛且种类繁多,目前发现并确定的蜱类约有7属47种。因此蜱传播疾病在云南大部分地区普遍存在,严重影响人民群众健康。然而在云南对AP的研究起步较晚,在人群、动物宿主和蜱媒中AP的分布和流行情况还不甚明了。本课题拟在云南省开展系统的AP感染情况调查,并将其结果与全球类似研究进行综合比较,以期深入研究AP在云南的发生和流行情况,进而有效防控HGA暴发流行和保护家畜健康,为制定公共卫生安全政策提供信息。同时,为了从不同角度认识这一新现热带传染病,以AP主要表面膜蛋白MSP2作为微观研究的切入点。因为MSP2作为AP主要膜优势抗原蛋白不仅含量丰富,而且在AP逃避宿主免疫中扮演重要角色,也一直是各种宿主中检测诊断AP感染的主要抗原,多项研究提示MSP2可能与AP致病有关。利用基因工程技术获取重组MSP2蛋白,可为深入研究AP的致病、诊断、疫苗奠定基础。[目 的]在云南省系统地了解探查AP在人群、宿主动物和传播媒介蜱虫中感染和携带情况,掌握该病原体的流行特征和相关流行因素。同时,重组AP膜表面蛋白MSP2,为探索开发适宜于云南实际情况的AP诊断检测手段,深入研究AP致病机制和制备相关疫苗奠定基础。[方 法]于2017-2018年期间在云南省各地选点,采集不同人群血液样本、不同动物血清样本和传播媒介蜱虫样本,利用ELISA和/或IFA对人和动物血清样本进行AP抗体检测,并对结果进行统计学计算,分析得到云南人群AP血清阳性率和动物血清阳性率;针对不明原因发热病人中检测到的AP IgM阳性的病例,将其全血标本提取DNA后利用巢式PCR对AP的16SrRNA、msp2、groEL等基因进行扩增,扩增成功条带测序后制作系统发育树;蜱虫标本提取DNA后利用AP特异性引物进行qPCR来寻找蜱感染AP的分子学证据;利用R软件对全球各地区人群AP血清阳性率进行meta分析,并与本文得到云南人群AP血清阳性率相比较;利用基因工程技术,构建msp2-PET-30a质粒,诱导表达rMSP2蛋白,并对表达蛋白进行纯化和鉴定。[结果]1.在云南省人群血清学调查研究中,共收集云南省4个地区1430份血液样本,其中健康人群1185份,发热病人245份。健康人群检测出AP IgG阳性共90例,阳性率为7.59%,发热病人检测出AP IgM 阳性共11份,阳性率4.49%。且发现男性和女性AP血清阳性率分别为9.29%,5.96%,两者有统计学差异。51-60岁年龄段AP血清阳性率最高,达18.64%。来自云南南部的调查人群AP血清阳性率高于云南中北部和西部人群。从11份AP IgM 阳性的病人全血中提取DNA,所有DNA样本经巢式PCR成功扩增16SrRNA、msp2基因,其中以16SrRNA基因属特异引物Eh-gs扩增测序后构建的系统发育进化树,显示来源于云南河口和云南砚山的AP分离株序列差异性较小,而且与分离自朝鲜的人源分离株(MH482862.1)及分离自捷克传播媒介嗜群血蜱分离株(KY462782.1)的序列相似性极高。2.在云南省动物及蜱媒AP感染的分布调查中,从云南多地共采集到山羊、牛、猪和鸭子等动物血清样品364份,蜱虫样本273份。经ELISA检测牛、羊、猪,的AP血清阳性率分别为8.42%、10.34%和5.56%。各地区间的感染率无统计学差异。蜱虫样本经种类鉴定,共有微小扇头蜱273只,混池法提取DNA 108份,qPCR检测没有阳性扩增样本。3.在全球人群AP血清阳性率meta分析中有71篇文献符合标准,36809人纳入研究,目标人群包括健康人群,不明原因发热患者人群,高危人群,被蜱叮咬人群和蜱传疾病患者人群。纳入研究的文献来自全球29个国家,主要集中于三个大洲即亚洲、欧洲和美洲,各项研究中AP血清阳性率从0到66.3%不等。Meta分析的结果显示全球人群中AP的合并感染率为10.2%(95%CI8.3%-12.4%),按照地区进行亚组分析的结果显示,亚洲地区人群的AP合并感染率最高为14.6%,95%CI(10.6%,19.2%),按照研究人群进行亚组分析的结果显示,高危职业人群的AP合并感染率最高为14.1%。敏感性分析显示本研究的合并结果稳健。Begger检验和egger检验提示研究存在一定的发表偏倚。4.合成msp2基因序列成功构建于PET-30a质粒上,诱导表达出重组rMSP2蛋白,并确定最佳诱导表达条件为以IPTG浓度为1.0mmol/L在37℃C温度条件下诱导4h。通过SDS-PAGE和Western-Blot鉴定无误后,对蛋白进一步纯化,最后对重组纯化的蛋白进行质谱检测鉴定,确定为APMSP2蛋白。[结 论]1.在云南省人群中发现AP感染的血清学和分子学证据。2.云南存在HGA急性期病例,传播风险较高。3.云南省人群感染的AP菌株序列相似,有人兽共患风险。4.有必要在云南省开展更系统更广泛的动物及蜱虫感染AP情况调查。5.全球人群中AP合并血清阳性率为10.2%,meta研究显示异质性可能来源于高危人群、发热人群和欧洲地区的研究。云南省健康人群AP血清阳性率与全球健康人群相似。6.本实验获得的重组rMSP2蛋白可作为下一步对AP进行基础研究的物质基础。