论文部分内容阅读
甾体皂苷（steroidal saponins）是一类重要的天然糖苷,广泛分布于高等植物和一些海洋生物中。甾体皂苷在抗肿瘤、抗真菌、防治心血管疾病等方面表现为良好的药理活性,是一类重要的药物资源。其活性不仅与苷元有关,而且与糖链部分有更密切的联系。糖链中单糖组成、连接方式、糖苷键的构型等都直接影响甾体皂苷的活性。本文对糖苷生物碱（glycoalkaloids）和薯蓣皂苷（dioscin和gracillin）两类结构相关的甾体皂苷成分进行了提取分离和结构鉴定,对甾体皂苷的糖链结构进行化学修饰,得到了6-OH选择性硫酸化、乙酰化、糖基化和酸水解等一系列修饰产物,采用MTT法分析了甾体皂苷及其衍生物对肿瘤细胞增殖的抑制作用。目的在于进一步研究甾体皂苷分子中糖链对其抗肿瘤活性的影响,并探讨其结构与生物活性的关系。从马铃薯（Solanum tuberosum L.）芽和龙葵（S. nigrum L.）果实中提取分离得到糖苷生物碱α-chaconine、α-solanine、α-solamargine和α-solasonine。由穿龙薯蓣（Dioscorea nipponica Makino）的根茎分离得到两种甾体皂苷dioscin和gracillin。产物经硅胶柱层析纯化,并通过薄层层析（TLC）、高效液相色谱（HPLC）和13C NMR方法鉴定了它们的结构。对三种糖苷生物碱成分chaconine、solanine和solamargine糖链部分的6-OH进行选择性硫酸化修饰,合成了6-O-sulfated chaconine、6-O-sulfated solamargine和6,6’-di-O-sulfated solanine。方法是利用糖苷生物碱糖链C-6位伯醇羟基化学反应的特殊性,使用DMT-Cl（4,4’-双甲氧基三苯甲基氯）对C-6位羟基进行选择性保护,然后将剩余羟基进行全乙酰化保护,使用三氟乙酸（TFA）的二氯甲烷液将C-6位伯醇羟基的DMTr保护基脱去,游离C-6位羟基,然后对C-6位羟基进行定位硫酸化修饰,最后脱去乙酰化保护,得到选择性硫酸化修饰产物。利用糖链C-6位羟基与其它次级羟基反应活性的差异,未经羟基保护,而直接对chaconine进行硫酸化修饰,同样得到了6-O-sulfated chaconine。反应只需一步完成,与上述采用保护基策略经多步合成反应得到硫酸化产物相比,方法简单。采用乙酸酐-吡啶法高产率（ 91 % ）合成了全乙酰化chaconine （per-O-acetyled chaconine）。合成了chaconine和solamargine葡萄糖基化产物。Koenigs-knorr法制备糖基化供体反应步骤少,操作简单,但反应产率不高。我们采用此方法对chaconine和solamargine糖链部分的6-OH进行选择性糖基化。采用前述方法制备6-OH游离的乙酰化chaconine和solamargine,再与四乙酰溴代葡萄糖供体反应生成6-葡萄糖基化产物,产率为41%～53%。合成了diosgenylβ-D-galacopyranosyl-（1→4）-β-D-glucopyranoside。糖的三氯乙酰亚胺酯法（Schmidt法）制备了乳糖供体。Diosgenin与乳糖供体在低温条件下（-20℃）反应,以BF3·Et2O作催化剂,生成乙酰基保护的糖基化产物,经NaOMe-MeOH液脱乙酰,得产物,产率达87%。合成了diosgenylβ-D-galacopyranosyl-（1→4）-β-D-glucopyranosyl （1→2）-β-D- glucopyranoside。从trillin出发,与苯甲醛在ZnCl2作催化剂条件下,高产率形成trillin吡喃葡萄糖4,6-位苯缩醛保护产物,产率为91%。产物在0℃下与特戊酰氯（Piv-Cl）反应,选择性保护trillin吡喃葡萄糖的C-3位羟基,得到4,6-位苯缩醛保护,3-位特戊酰基保护,只有2-位羟基游离的trillin糖基化受体。受体与乳糖供体在-20℃下,以BF3·Et2O为催化剂进行糖基化反应。产物产率为65%。产物经脱保护基,得到diosgenylβ-D-galacopyranosyl-（1→4）-β-D-gluco- pyranosyl（1→2）-β-D-glucopyranoside（产率81%）。对三种甾体皂苷类化合物solamargine、solasonine和dioscin进行了酸水解,并研究了水解的选择性,制备了一系列糖链长度不同的酸水解产物。采用TLC和13C NMR波谱鉴定了水解产物的结构。结果表明,solamargine水解得到β1-、β2-、γ-solamargine和solasodine四种产物。Solasonine得到三种水解产物,β1-solasonine无法得到,可能是其不稳定所致。γ-Solasonine的产率也很低,这可能是因为β-solasonine产物直接水解生成苷元或γ-solasonine不稳定而迅速水解生成苷元所致。Dioscin的酸水解得到四个产物,用浓度为2%的H2SO4水解dioscin,在90℃条件下反应75min,主要得到γ-dioscin（trillin）水解产物,具有很好的选择性;而用5%的H2SO4水解,在75℃下反应75min,则得到β-dioscin为优势水解产物。研究了糖苷生物碱及其衍生物的抗肿瘤活性及构效关系。采用MTT法分析了糖苷生物碱及其衍生物对HCT-8肿瘤细胞增殖的抑制作用。四种糖苷生物碱chaconine、solanine、solamargine和solasonine对HCT-8肿瘤细胞增殖有很好的抑制作用,IC50值分别为7.12,10.9,10.63, 16.04μM。抑制作用在140μM范围内呈浓度依赖关系。三种6-OH选择性硫酸化的糖苷生物碱（6-O-sulfated glycoalkaloids）对HCT-8肿瘤细胞无抑制作用（IC50 >40μM）。β1-,β2-,γ- solamargine和β2- ,γ-solasonine水解产物活性明显降低。苷元solasodine在低浓度（7.5μM）下有一定活性。构效关系分析表明,糖苷生物碱糖链的6-OH对其发挥抗肿瘤作用至关重要,可能是发挥抗肿瘤作用的活性中心。采用MTT分析法研究了solamargine、solasonine、gracillin、dioscin及其水解产物和两种新合成甾体皂苷对L929、Hela和H7402肿瘤细胞的抑制作用。结果表明,solamargine和dioscin对三种肿瘤细胞都有明显的抑制作用,而solasonine和gracillin的抑制作用很弱。新合成甾体diosgenylβ-D-galacopyranosyl- （1→4）-β-D-glucopyranoside对L929肿瘤细胞有一定的抑制作用,而化合物Diosgenylβ-D-galacopyranosyl-（1→4）-β-D-glucopyranosyl （1→2）-β-D-gluco pyrano side无活性。Dioscin的β1水解产物有一定的活性,而β2-、γ-dioscin和diosgenin无活性。构效关系分析表明,以chacotriosyl为糖链的甾体皂苷（solamargine和dioscin）抗肿瘤活性明显高于其它糖链的甾体皂苷。Dioscin的水解产物活性明显降低,说明糖链长度直接影响甾体皂苷的活性。β1-dioscin有一定的活性,而β2-dioscin无活性,说明糖链的连接位置显著影响甾体皂苷的生物活性。