研究背景及目的:缺氧缺血性脑病(HIE)是各种原因引起的脑组织缺血、缺氧而导致的脑组织损伤,最常见的是新生儿缺氧缺血性脑病。新生儿缺氧缺血性脑病作为各种围生期窒息引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停从而导致胎儿或新生儿脑损伤的一类疾病,是围产期窒息后常见并发症,临床上常常会表现出儿童智力、行为障碍等神经系统后遗症,严重者甚至可导致新生儿的死亡。迄今为止,关于新生儿HIE发病机制尚未完全阐明,目前的研究表明,缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的发生是一个多因素参与介导地综合性的病理过程。其病理生理可能与能量耗竭、氧自由基、Ca2+过量内流、兴奋性氨基酸等因素相关,以上因素相互作用,促使脑细胞凋亡,最终导致脑组织结构破坏甚至死亡。复杂的病理生理机制决定了 HIE的治疗是一个很复杂的过程,目前尚缺乏特效疗法。如何尽早进行正规的治疗和干预就成为大家一直以来研究的热点。近年来,很多天然产物因具有神经保护作用可以改善缺血性脑损伤而成为研究的热点。本研究主要通过水苏碱抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性来探讨水苏碱在改善新生大鼠脑缺氧缺血性损伤(HIBD)方面的作用及其可能的作用机制,从而为临床HIE的诊疗提供有效的理论依据及数据参考。研究方法:1、创建动物模型选取7日龄(P7)Sprague-Dawley(SD)大鼠共 112只,体重(12.1-16.5)g,雌雄不拘,参照Rice及改良法等方法制作新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型,随机分为4组:1)正常对照组(Sham组,n=12);即假手术组,正常大鼠,仅分离左侧颈总动脉,挂线不结扎,不进行通混合气体;2)阴性对照组(Con组,n=20):HIBD大鼠,给予生理盐水治疗;3)低剂量水苏碱治疗组(L组,n=40):HIBD大鼠,给予水苏碱腹腔内注射,5mg/kg/d;4)高剂量水苏碱治疗组(H组,n=40):HIBD大鼠,给予水苏碱腹腔内注射,10mg/kg/d。以上所有组大鼠均给予为期5天的治疗。2、留取新生大鼠脑组织标本完成治疗方案后12小时(P12)评估每只新生大鼠的体重和温度,将所有的新生大鼠麻醉(苯巴比妥)后,心内灌注后取大脑组织。将获取的各组大脑组织再随机分为两组,其中一组(n=77)冷冻储存于-70℃液态氮储存罐中用于蛋白的评估,另一组(n=35)制作蜡块以备进行TUNEL染色。3、评估脑组织的相关指标对留取的所有大鼠脑组织标本进行梗死面积、细胞凋亡、HDAC活性及生化指标等方面进行检测或评估。具体如下:1)梗死面积的评估:应用2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法,切片后应用图像分析软件计算梗死面积;2)细胞凋亡的评估:应用TUNEL染色法,凋亡阳性细胞显色为棕黄色,采用对脑组织的石蜡切片中随机计算3个高倍镜视野中TUNEL染色阳性皮层细胞占总皮层细胞百分率的方法(以%表示);3)HDAC活性的检测:应用比色检测法,测定405nm处的吸光度,采用与Sham组比较的方法(以%表示);4)乙酰化H3和H4蛋白表达水平的检测:应用Westernblot法,应用采用与Sham组比较的方法(以%表示);5)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等细胞因子的检测:应用全自动生化分析仪AU5821测定新生大鼠脑组织匀浆上清液中各个指标的表达水平。6)TNF-α、IL-10等细胞因子的检测:应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法,测定新生大鼠脑组织匀浆上清液中各个指标的表达水平。4、统计学分析使用SPSS18.0软件对统计学数据进行分析。计量资料以X±S表示,计数资料以数值和百分比表示。统计分析采用t检验、单因素方差(Oneway ANOVA)分析或LSD post.hoc分析。当p<0.05被认为具有显著性统计学差异。研究结果:1.水苏碱对梗死面积的影响Con组大鼠脑组织的梗死面积(224 mm2)明显高于Sham组的(20 mm2),且差异有统计学意义(P<0.01),说明缺氧条件下大鼠脑组织梗死面积明显增加。水苏碱治疗组脑梗死面积(L组:89 mm2;H组:53 mm2)较Con组大鼠显著降低(p<0.01)。皮质下区域各组梗死面积变化不大,差异无统计学意义(p>0.05)。2.水苏碱对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织细胞凋亡方面的影响Con组大鼠脑组织的细胞凋亡率为23.8%,明显高于Sham组的3.5%,且差异有统计学意义(p<0.01),说明缺氧缺血条件下新生大鼠脑组织细胞凋亡明显增加。经水苏碱治疗组脑细胞凋亡率(L组:11.4%;H组:5.6%)较Con组大鼠显著降低,差异有统计学意义(p<0.01)。3.水苏碱对HDAC活性的作用水苏碱可以降低缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织中的HDAC酶的活性,且存在剂量依赖性,差异有统计学意义(p<0.01)。其中,Con组的HDAC活性约为238%,经水苏碱治疗后,L组降至179%,而H组下降更明显至136%。另外,经水苏碱治疗组中乙酰化蛋白H3和H4在缺血新生大鼠脑组织中的表达水平明显增加,差异有统计学意义(p<0.01)。4.水苏碱对脑组织中细胞因子表达水平的影响Con组中HIBD新生大鼠脑组织TNF-α水平(169 pg/100 mg)较sham组(48 pg/100mg)显著升高,差异有统计意义(p<0.01)。然而,经水苏碱治疗后TNF-α表达水平明显降低(L组为98 pg/100 mg,H组为71 pg/100 mg)(p<0.01,p<0.01)。此外,水苏碱治疗后IL-10的表达水平亦有明显增加(p<0.05,p<0.01)。值得一提的是,研究发现水苏碱对TNF-α和IL-10表达水平的作用存在剂量依赖性,差异有统计意义(p<0.01,p<0.01)。5.水苏碱在氧化应激方面的作用Con组HIBD新生大鼠脑组织中氧化应激指标如SOD、GSH-PX等指标明显降低,其中Sham组中SOD及GSH-PX的表达水平分别为2.67±0.23 U/100 mg及192.7±8.3 U/100 mg,而Con组中的表达水平分别为0.79±0.12 U/100 mg及96.8±5.9 U/100mg,具有显著性统计学差异(p<0.01,p<0.01)。但经水苏碱治疗后的表达比Con组显著增加(p<0.01,p<0.01),SOD及GSH-PX的表达水平在低剂量组(L组)和高剂量组(H组)分别为1.73±0.19 UU/100mg及130.6士7.2 U/100mg和2.18±0.20 U/100 mg及 169.2±8.1 U/100 mg。结论:1.缺氧缺血可导致新生大鼠脑组织梗死,而经水苏碱治疗后脑梗死体积明显减少,说明水苏碱能够改善脑组织的梗死。2.水苏碱可以通过降低HIBD新生大鼠脑细胞凋亡率从而改善缺氧缺血导致的脑组织损伤。3.水苏碱可以降低HIBD大鼠脑组织中的HDAC酶的活性,从而提示水苏碱可能通过这种方式保护及改善受损的大鼠脑组织。而且进一步研究发现水苏碱对HDAC活性的抑制作用存在剂量依赖性。本实验主要研究从水苏碱改善HIBD大鼠脑组织中乙酰化H3和H4蛋白的高表达方面来证实其保护受损脑组织的可能发生机制。4.水苏碱可以降低HIBD大鼠脑组织损伤导致的细胞因子如TNF-α高表达及提高IL-10的表达,说明水苏碱在一定程度上可以降低细胞因子对细胞的破坏作用和减少单核-吞噬细胞功能的抑制作用。另外,同上面的抑制HDAC活性一样,我们发现其对细胞因子的作用也存在剂量依赖性,充分提示水苏碱可以保护脑组织减少进一步的损伤。5.水苏碱可以提高氧化应激反应的相关指标如SOD、GSH-PX的表达,从而保护脑细胞免受内源性超氧化物自由基阴离子的毒害作用,这也可能是水苏碱改善脑损伤的机制之一。意义本研究证实了水苏碱在HIBD大鼠中具有的神经保护作用,其可以明显改善脑组织的损伤程度,为临床HIE的诊断及治疗提供了很好的思路及理论依据。我们进一步研究发现其神经保护作用的机制可能是其具有抑制新生大鼠脑组织中HDAC的活性和降低氧化应激反应及神经元炎症反应的作用。