缺血性心肌病(Ischemic heart disease;IHD)具有较高死亡率和致残率，已成为危害患者健康的一类重要疾病，随着人们生活水平提高及人口老龄化的来临，冠心病并发缺血性心肌病的发病率呈增高趋势。目前主要有药物治疗、介入支架植入及冠状动脉旁路移植三种治疗方式，然而这些方法均不能挽救已经濒死的心肌细胞，心肌细胞因缺血发生不可逆性坏死、凋亡，最终发展为终末期心力衰竭。因此寻找一种能够挽救濒死的心肌细胞或再生出新的心肌细胞的方法，至今仍然是一个充满期待的科学问题。近年随着干细胞在再生医学中的一系列进展，间充质干细胞(mesenchymal stem cells; MSCs)移植为治疗缺血性心肌病带来新的曙光。　　MSCs具有多向分化潜能及免疫调节功能，使得MSCs成为再生医学最具治疗前景的干细胞之一。近年来MSCs被应用到心肌修复和重建，MSCs移植能够减少心肌梗死面积。然而MSCs移植治疗心肌梗死受到多种因素限制，包括来源骨髓等组织的原代间充质干细胞数量有限，需要通过体外粘附培养方法扩增细胞，然后再移植到心肌梗死患者体内。移植体内的MSCs面临存活率低下及存活时间短的问题，影响MSCs治疗心肌梗死的效果。目前一些研究发现炎症反应、梗死心肌组织周围局部环境缺氧及氧化应激等因素是影响MSCs体内存活的主要原因。　　Vunjak-Novakovic等研究发现:细胞和非细胞成分构成干细胞生存的微环境。粘附培养状态是原代MSCs扩增过程中细胞微环境的重要组成部分，MSCs脱离粘附培养状态后可能发生细胞凋亡增加，导致MSCs移植到体内后存活率低下。该研究通过超低吸附培养板模拟MSCs去粘附培养状态，研究去粘附培养状态对MSCs凋亡的影响及可能的分子机制。为研究MSCs移植治疗心肌梗死细胞低存活问题提供新的思路和原因。本文分为几个部分展开。　　第一部分:人骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定　　目的:　　通过传统密度梯度离心法分离单核细胞，进一步通过塑料贴壁粘附培养方法获得纯化的人骨髓间充质干细胞，并对分离细胞进行鉴定，为研究去黏附培养状态对MSCs凋亡影响实验提供实验细胞。　　方法:　　1.募集3名20-25岁志愿者，从志愿者髂后上棘穿刺，抽吸4ml骨髓/人。　　2.采用密度梯度离心法去除红细胞，获得骨髓单核细胞。　　3.通过塑料贴壁粘附培养方法，进一步纯化骨髓间充质干细胞。　　4.体外通过塑料贴壁粘附培养方法，扩增传代原代骨髓间充质干细胞(P0)到第二代(P2)，冻存部分P2细胞备实验使用。　　5.P2骨髓间充质干细胞进行成骨、成脂及成软骨多向诱导分化实验，鉴定MSCs多向分化潜能。　　6.P2骨髓间充质干细胞进行CFU-Fs实验，验证MSCs自我克隆能力，对MSCs进行功能鉴定。　　7.流式细胞术分析MSCs表型分子:CD11b，CD14，CD34，CD45，CD73，CD90和CD105　　结果:　　1.P2培养细胞能够进行成骨、成脂及成软骨诱导分化。　　2.在CFU-Fs实验中，MSCs形成良好的细胞克隆。　　3.CD14，CD34，CD11b和CD45表达＜1％; CD73，CD90和CD105表达＞99％。　　结论:　　密度梯度离心+塑料贴壁粘附培养方法分离的细胞具有良好的多向诱导分化潜能和自我克隆形成能力，具备间充质干细胞分子表型特性。　　第二部分:去粘附培养对人骨髓间充质干细胞凋亡影响　　目的:　　研究去贴壁黏附培养状态对hMSCs凋亡的影响。　　方法:　　1.将P2骨髓间充质干细胞种植到超低吸附组织培养板（非粘附培养），细胞悬浮在培养基中，分别培养24h、72h。同时将P2骨髓间充质干细胞种植到组织培养板，分别黏附培养24h、72h，作为对照组。　　2.流式细胞分析24h、72h2个时间点非黏附培养和黏附培养MSCs凋亡变化。　　3.对72h时间点黏附培养和非粘附培养MSCs再种植到组织培养板，进行粘附培养，评估MSCs经非粘附培养处理后成骨及成软骨多向分化潜能及细胞生长特性。　　结果:　　1.流式细胞术分析MSCs凋亡:非黏附培养MSCs与粘附培养MSCs凋亡24h时间点差异没有统计学意义（P＞0.05）;72h时间点非黏附培养MSCs与粘附培养MSCs凋亡差异有统计学意义（P＜0.01）。　　2.72h时间点非粘附培养细胞种植到组织培养板后表现梭性形态生长，具有良好的成软骨、成脂分化能力。　　结论:　　1.人骨髓间充质干细胞脱离粘附培养状态后凋亡增加。　　2.人骨髓间充质干细胞非粘附培养处理后仍具有间充质干细胞生长形态，具有良好的成软骨、成脂多向诱导分化能力。　　第三部分:人骨髓间充质干细胞去贴壁粘附培养凋亡机制　　目的:　　分析人骨髓间充质干细胞去黏附培养状态后细胞凋亡增加的可能分子机制。　　方法:　　1.将P2 hMSCs种植到超低吸附培养板，分别进行24h、72h非粘附培养。同时将相同数量的P2 hMSCs种植到组织培养板进行24h、72h粘附培养作为对照组。　　2.提取取24h和72h粘附培养hMSCs和非粘附培养hMSCs的mRNA进行qPCR实验，比较非黏附培养hMSCs和黏附培养hMSCs相关凋亡基因:caspase3，caspase7，caspase8和caspase9表达变化。　　3.提取取24h和72h粘附培养hMSCs和非粘附培养hMSCs蛋白进行Westernblots实验，比较非黏附培养细胞和黏附培养hMSCs相关凋亡蛋白:caspase3，caspase7，caspase8和caspase9表达变化。　　结果:　　1.hMSCs非黏附培养24h后，凋亡基因:caspase3，caspase7，caspase8和caspase9表达变化没有统计学意义（P＞0.05）;hMSCs非黏附培养72h后，caspase7，caspase8和caspase9表达增加（P＜0.05），caspase3表达没有变化（P＞0.05）。　　2.hMSCs非黏附培24h后，凋亡蛋白:caspase3，caspase7，caspase8和caspase9表达变化没有统计学意义（P＞0.05）;hMSCs非黏附培养72h后，凋亡蛋白caspase7，caspase8和caspase9水平下降（P＜0.05），caspase3蛋白水平没有变化（P＞0.05）。　　结论:　　hMSCs去贴壁粘附培养状态后通过内源性信号通路发生凋亡，caspase7，caspase8和caspase9参与细胞凋亡过程。