西兰花(Brassica oleracea var.italica)又名花椰菜,是十字花科(Brassicaceae)芸薹属(Brassica)植物中的一种重要植物,原产地为意大利。由于西兰花富含多种营养物质,如蛋白质、糖、脂肪、维生素和胡萝卜素等,且营养成份居于同类蔬菜之首,因此具有“蔬菜皇冠”的美誉。西兰花中含有丰富的芥子油苷,而西兰花花球中的脂肪族芥子油苷所占比例最高,且脂肪族芥子油苷中的4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷(萝卜硫苷)其降解产物萝卜硫素具有显著的抗癌活性。西兰花中含有的萝卜硫素(sulforaphane)是异硫氰酸酯衍生物中具有最强抗癌活性的一种物质,对乳腺癌、胃癌作用明显,因而备受关注。因此,利用遗传学及转基因技术提高西兰花中脂肪族芥子油苷含量,使得萝卜硫素的含量增加,从而获得高抗病、抗癌的西兰花对于科研和医学领域都具有重要意义。本文以西兰花为实验材料,根据前期西兰花转录组测序结果与数据库中的基因序列进行比对,设计特异性引物。利用RT-PCR技术克隆得到西兰花CYP83A1基因的CDS序列,命名为BoCYP83A1。BoCYP83A1的基因序列、蛋白序列、理化性质等相关信息是利用生物信息学中的相关生物软件进行分析获得,通过生物学软件构建系统发育树,明确BoCYP83A1基因在十字花科植物基因组中的进化地位。以BoCYP83A1基因为目的基因构建35S∷BoCYP83A1植物表达载体,利用农杆菌介导方法进行拟南芥侵染,采用PCR及RT-PCR技术对拟南芥转基因植株进行DNA与RNA水平的检测。利用超高效液相色谱法(UPLC)对35S∷BoCYP83A1转基因拟南芥植株进行芥子油苷种类与含量的测定,探究BoCYP83A1基因在西兰花脂肪族芥子油苷合成途径中的作用。为真正实现西兰花在萝卜硫素产量提高上提供充足的理论依据,为最终获得高抗癌活性的西兰花品种奠定基础。本研究中得到的主要实验结果如下:1.首次获得西兰花CYP83A1的CDS序列通过RT-PCR方法,首次从西兰花四周大叶片中克隆获得CYP83A1的CDS序列,并命名为Bo CYP83A1。2.BoCYP83A1的生物信息学分析BoCYP83A1基因CDS序列全长为1509bp,此基因共编码502个氨基酸(GenBank序列号为KM111290)。BoCYP83A1的蛋白分子式、分子量大小和等电点分别为C2600H4058N674O736S29、57.47 kD和7.1,属于稳定的亲水性蛋白;二级结构为混合型蛋白;三级结构预测与二级结构结果相同;BoCYP83A1含有卷曲螺旋结构,具有跨膜结构域,无信号肽,属于非分泌型蛋白;BoCYP83A1含有51个潜在的O-糖基化位点,N-糖基化位点不存在,其中包含4个Tyr位点、6个Thr和Ser位点以及16个蛋白激酶磷酸化位点。氨基酸序列分析表明它与与油菜、大白菜、萝卜、小白菜、黑芥菜、玉山筷子芥和拟南芥的氨基酸同源性分别为98%、98%、97%、97%、92%、89%、88%。BoCYP83A1基因的蛋白序列与7个物种的CYP83A1构建系统发育树,表明西兰花与这7种植物具有共同起源,但功能上存在分支。3.植物超表达载体的构建对pCAMBIA230035Su进行改造后将npt II为筛选标记基因,利用CaMV35s启动子驱动BoCYP83A1过量表达。4.35S∷BoCYP83A1转基因植株的分子生物学检测利用含有100mg/ml卡那霉素的2/1MS培养基筛选,初步获得15株拟南芥抗性苗。其中,DNA水平PCR检测阳性植株为14株。以上述阳性植株为供试材料进行RT-PCR检测,显示4个样品为阳性,说明这四株阳性植株是35S∷BoCYP83A1转基因拟南芥植株。5.35S∷BoCYP83A1转基因植株芥子油苷含量的测定利用超高效液相色谱系统检测芥子油苷组分及含量,检测结果表明在35S∷BoCYP83A1转基因拟南芥植株中脂肪族芥子油苷总含量升高,吲哚族和芳香族芥子油苷总含量下降。其中3MS0P、4MS0B、4MTB、5MS0P、6MS0H等脂肪族芥子油苷的含量都有所上升,其中4MS0B(4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷)和4MTB(4-甲硫丁基脱硫芥子油苷)变化明显。35S∷Bo CYP83A1转基因拟南芥植株中的吲哚族芥子油苷I3M(吲哚基-3-甲基芥子油苷)和1MOI3M(1-甲氧吲哚基-3-甲基芥子油苷)含量降低,4MOI3M(4-甲氧吲哚基-3-甲基芥子油苷)无含量变化,同时芳香族芥子油苷(Benzyl)含量下降。上述结果说明,BoCYP83A1基因的功能是参与调控脂肪族芥子油苷合成途径。6.35S∷BoCYP83A1转基因植株的表型分析35S∷BoCYP83A1转基因植株与野生型相比,转基因植株提前抽薹开花。这一现象说明,过量表达BoCYP83A1后不仅参与调控脂肪族芥子油苷合成途径,而且使得植物体内激素含量升高。