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目的： 通过原核基因工程技术重组表达登革2型病毒NS2B催化活性区域（NS2BH）与NS3蛋白酶区域(NS3pro)复合物，并对其蛋白酶活性进行检测，建立重组蛋白克隆表达和纯化的工艺，为后续的登革病毒蛋白酶适配体抑制剂筛选提供重要的物质基础。 方法： 1．利用重叠PCR扩增登革2型病毒NS2B催化活性区域(NS2BH)和NS3蛋白酶区域(NS3pro)基因序列，以pET-28b构建NS2BH-NS3pro复合物两种不同类型的原核表达载体，其中连接型重组蛋白酶复合物（本文统称为NS2BH-G4TG4-NS3pro）通过引入G4TG4连接臂，将NS2BH和NS3pro共价连接表达，而非连接型重组蛋白酶复合物（本文统称为NS2BH/NS3pro)则引入核糖体结合位点序列（Shine-Dalgarno sequence,SD），使NS2BH和NS3pro以非共价的方式在同一个质粒载体被诱导表达。重组质粒经基因测序鉴定正确后，转化至大肠杆菌BL21内，通过IPTG诱导获得重组蛋白的高效表达，并采用Ni-NTA亲和层析技术纯化重组蛋白； 2．采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption ionizationtime offlightmassspectrometry，MALDI-TOF-MS）技术，对重组蛋白NS2BH-G4TG4-NS3pro和NS2BH/NS3pro进行检测分析，并与SwissProt数据库比对鉴定重组蛋白； 3．利用荧光共振能量转移（Fluorescence resonanceenergy transfer，FRET）技术检测重组蛋白 NS2BH-G4TG4-NS3pro和 NS2BH/NS3pro对荧光底物Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC的酶切活性。实验设缓冲液、缓冲液加荧光底物及检测体系加入蛋白酶广谱抑制剂抑肽酶（Aprotinin）三个对照组，每个实验组设置3个重复，利用多功能酶标仪上检测各个实验组在激发波长360nm，发射波长450nm反应初始10min的荧光强度，检测频率为30s一次。 结果： 1．成功构建连接型蛋白酶复合物pET-28b-NS2BH-G4TG4-NS3pro和非连接型蛋白酶复合物pET-28b-NS2BH/NS3pro原核表达载体，测序结果表明克隆的目的基因与数据库的参考序列一致；通过优化诱导表达，获得了重组蛋白的可溶性表达，经Ni-NTA亲和层析技术纯化后，获得了与预期分子量大小相符且纯度较高的目的蛋白。 2． MALDI-TOF-MS分析结果两种重组蛋白均被鉴定为登革2型病毒基因组多聚蛋白，两种重组蛋白的肽质量指纹图谱PMF与Swiss-Prot数据库中的数据匹配度高，显示诱导表达的重组蛋白正是NS2BH-G4TG4-NS3pro和NS2BH/NS3pro；3．酶活性检测分析结果表明，重组蛋白NS2BH-G4TG4-NS3pro、NS2BH/NS3pro均能切割催化底物Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC产生较强的荧光值，而缓冲液、缓冲液加底物及Aprotinin对照组因底物不能被切割产生荧光值较低。 结论： 1．通过基因工程技术成功建立了连接型pET-28b-NS2BH-G4TG4-NS3pro和非连接型pET-28b-NS2BH/NS3pro两种形式登革2型病毒蛋白酶复合物的原核表达质粒，在大肠杆菌中实现了NS2BH-G4TG4-NS3pro和NS2BH/NS3pro的可溶性表达；2．重组蛋白NS2BH-G4TG4-NS3pro、NS2BH/NS3pro具有较高的蛋白酶活性，为后续登革病毒蛋白酶适配体抑制剂的筛选奠定了坚实的实验基础。