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胚蛋注射(In ovo feeding,IOF)营养素或活性物质是一种调控家禽早期营养的有效技术手段。丙酮酸肌酸(Creatine pyruvate,CrPyr)是一种新型营养素,它兼具肌酸的特性和丙酮酸的功能。研究表明,CrPyr对肉鸡能量代谢有积极作用,能增强机体的能量供应、促进肌肉发育。但目前关于胚蛋注射CrPyr调控肉鸡能量代谢和肌肉发育的研究还未见报道。本研究拟选取CrPyr为外源营养物质,研究胚蛋注射CrPyr对商品代种蛋孵化性能、肉鸡生长性能、能量代谢和肌肉发育的影响,并通过检测LKB1/AMPK和Wnt/β-catenin信号通路关键因子的表达,结合肌肉蛋白组学分析,揭示胚蛋注射CrPyr调控肉鸡能量代谢和肌肉发育的作用机理。1.胚蛋注射不同浓度的丙酮酸肌酸对孵化性能、肉鸡生长性能和能量储备的影响试验一采用单因素试验设计。选取1400枚蛋重基本一致的AA鸡商品代受精蛋入孵。孵化16 d时通过照蛋选取1200枚发育良好的受精蛋,随机分配到5个处理,每个处理8个重复,每个重复30枚,称重后编号(平均蛋重为56.64 士0.51 g)。在孵化期第17.5 d时进行胚蛋注射试验。5个处理包括:(Ⅰ)空白对照组,不进行注射(Control);(Ⅱ)生理盐水对照组,NaCl 4.5 mg(Saline);(Ⅲ)CrPyr 3 mg,NaCl 4.5 mg(CrPyr3);(Ⅳ)CrPyr 6 mg,NaCl 4.5 mg(CrPyr6);(ⅤV)CrPyr 12 mg,NaCl 4.5 mg(CrPyr12)。每枚胚蛋注射剂量为0.6 mL。出壳后,从每个处理中分别选取与本处理平均体重接近且体重均匀的80只公雏,随机分成8个重复,每个重复10只,进行饲养试验。饲养期21 d。结果显示,各处理组肉鸡种蛋的孵化率、1-7 d的采食量、体增重及各阶段料重比均无显著差异(P>0.05);与Control和Saline组相比,CrPyr12组显著提高了雏鸡的孵化重及肉鸡3 d和7 d的体重,而CrPyr6和CrPyr12组显著提高了肉鸡21 d的体重(P<0.05),提高了肉鸡8-21 d及1-21 d的采食量和体增重(P<0.05);随着CrPyr注射浓度的提高,肉鸡的孵化重、3、7、21 d体重,及8-21 d和1-21 d的采食量和体增重呈一次线性(Linear)和二次曲线(Quadratic)变化规律(P<0.05);与Control和Saline组相比,CrPyr均可提高孵化19 d鸡胚、出壳当天及3 d肉鸡卵黄囊的绝对重量和相对重量(Linear和Quadratic,P<0.05),CrPyr6和CrPyr12还显著提高了孵化19 d鸡胚以及出壳当天、3d、21 d肉鸡的胸肌重和胸肌相对重量(P<0.05),且随着CrPyr注射浓度的提高,各个时间点胸肌绝对重量与相对重量均呈一次线性(Linear)和二次曲线(Quadratic)变化规律(P<0.05);与 Control 和 Saline组相比,CrPyr显著提高了出壳当天和3 d肉鸡血液丙酮酸的浓度,提高了出壳当天肉鸡血液肌酸的浓度(P<0.05),且具有剂量效应(Linear和Quadratic,P<0.05);CrPyr各组提高了孵化19 d鸡胚肝脏丙酮酸的浓度(P<0.05),CrPyr6和CrPyr12组提高了孵化19d鸡胚和出壳当天肉鸡肝脏葡萄糖的浓度、及孵化19d鸡胚和出壳当天、3 d肉鸡肝糖原的浓度(P<0.05);与Control和Saline组相比,CrPyr各组显著提高了孵化19 d鸡胚和出壳当天肉鸡胸肌肌酸的浓度(P<0.05),提高了孵化19 d鸡胚胸肌磷酸肌酸的浓度(P<0.05);孵化19d鸡胚和出壳当天肉鸡肝脏丙酮酸和葡萄糖浓度,孵化19d鸡胚、出壳当天、3日龄、7日龄肉鸡肝糖原浓度,孵化19d鸡胚、出壳当天及3日龄肉鸡胸肌肌酸浓度,以及孵化19 d鸡胚胸肌磷酸肌酸浓度随CrPyr注射浓度的提高呈一次线性(Linear)和二次曲线(Quadratic)变化规律(P<0.05)。2.胚蛋注射丙酮酸肌酸对孵化性能、肉鸡生长性能、能量代谢关键酶活性及相关基因表达的影响试验二采用单因素试验设计。选取1200枚蛋重基本一致的AA鸡商品代受精蛋入孵。孵化16 d时通过照蛋选取960枚发育良好的受精蛋,随机分配到3个处理,每个处理8个重复,每个重复40枚,称重后编号(平均蛋重为64.50 ±0.38 g)。在孵化期第17.5 d时进行胚蛋注射试验。3个处理组分别为:(Ⅰ)空白对照组,不进行注射(Control);(Ⅱ)生理盐水对照组,NaCl 4.5 mg(Saline);(Ⅲ)CrPyr 12 mg,NaCl 4.5 mg(CrPyr)。每枚种蛋注射注射剂量为0.6 mL。出壳后,从每个处理中分别选取与本处理平均体重接近且体重均匀的120只公雏,随机分成8个重复,每个重复15只鸡,进行饲养试验。饲养期42 d。结果显示,不同处理间肉鸡种蛋的孵化率无显著差异(P>0.05);与Control和Saline组相比,CrPyr组显著提高了雏鸡的孵化重,以及3 d、7 d、21 d和42 d的体重、及肉鸡1-21 d、22-42 d及1-42 d的采食量和体增重;与Control和Saline组相比,CrPyr组提高了孵化19 d鸡胚胸肌ADP的浓度(P<0.05),降低了胸肌ATP的浓度(P<0.05),CrPyr组提高了肉鸡出壳当天胸肌ATP的浓度(P<0.05),降低了 ADP的浓度(P<0.05);与Control和Saline组相比,CrPyr组显著提高了出壳当天和3 d肉鸡血浆胰岛素的浓度及当天肉鸡血浆甲状腺素(T4)的浓度;与Control和Saline组相比,CrPyr组提高了孵化19 d鸡胚肝脏葡萄糖-6-磷酸酶的活性和胸肌肌酸激酶(CK)的活性(P<0.05),提高了出壳当天肉鸡胸肌己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)的活性(P<0.05);胚蛋注射CrPyr提高了孵化19 d鸡胚和出壳当天肉鸡肝脏丙酮酸羧化酶(PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和糖原合成酶(GYS)的基因表达量,提高了肉鸡出壳当天胸肌葡萄糖转运载体(GLUT3、GLUT8)的基因表达量(P<0.05);此外,胚蛋注射CrPyr显著提高了肉鸡出壳当天胸肌中磷酸化的LKB1和磷酸化的AMPK蛋白的表达水平(P<0.05),但对LKB1和AMPK蛋白的表达水平无显著影响(P>0.05)。3.胚蛋注射丙酮酸肌酸对肉鸡肌肉生长发育调控和宰后肉品质的影响及其作用机理的研究试验设计同试验二。结果显示,与Control和Saline组相比,CrPyr组显著提高了孵化19d鸡胚以及出壳当天、3d、7d、21 d及42d肉鸡的胸肌重和胸肌相对重量(P<0.05),并显著提高肉鸡3d、7 d、21 d和42 d胸肌肌纤维直径和肌纤维横截面面积(P<0.05),但对42日龄肉鸡胸肌pH45min值、pH24h值、肉色(L*,a*,b*)、滴水损失、蒸煮损失和剪切力值等均无显著影响(P>0.05);与Control和Saline组相比,胚蛋注射CrPyr显著提高了 3日龄肉鸡胸肌卫星细胞有丝分裂活性指数(P<0.05);与Control和Saline组相比,胚蛋注射CrPyr显著提高了出壳当天肉鸡胸肌MyoD和Myf5 基因表达量(P<0.05),及 3 日龄胸肌 MyoD、Myf5、Myogenin、MRF4 和 Pax7基因表达量(P<0.05),降低了 3日龄肉鸡胸肌Myostatin基因表达量(P<0.05);与Control和Saline组相比,CrPyr组肉鸡显著提高了 3日龄肉鸡胸肌Wnt3a的基因表达量(P<0.05),降低了 GSK-3β基因表达量及GSK-3β总蛋白和磷酸化蛋白的表达水平(P<0.05),并显著提高了 3日龄肉鸡胸肌β-catenin蛋白的表达水平(P<0.05),降低了磷酸化的β-catenin蛋白的表达水平(P<0.05)。4.胚蛋注射丙酮酸肌酸对肉鸡胸肌蛋白表达谱的影响试验设计同试验二。采用iTRAQ技术对出壳当天和3日龄肉鸡胸肌进行蛋白组学分析。本研究发现与空白对照组相比,胚蛋注射CrPyr组肉鸡在出壳当天上调了胸肌中22种蛋白的表达,同时下调了 11种蛋白的表达;在3日龄上调了 11种蛋白的表达,下调了 9种蛋白的表达。通过GO显著性分析确定,出壳当天CrPyr组差异蛋白主要参与肌肉发育、系统发育、组织结构发育、器官发育、肌肉中肌丝的滑动、肌球蛋白丝滑动、组织结构形态学发育、细胞分化、肌肉形态学发育、ATP酶活性的调节、肌纤维的发育等生物过程;主要参与肌球蛋白、Ⅱ型肌球蛋白、肌球蛋白丝、肌节、收缩纤维、肌动蛋白细胞骨架等细胞组分;主要参与肌动蛋白结合的ATP酶活性、Ca2+-ATP酶活性、脂肪酶联结、酶抑制剂活性、肌肉结构组成等分子功能;基于KEGG数据库对肉鸡出壳当天差异蛋白进行分析,主要与肌纤维的紧密连接和甲状腺激素信号通路相关。3日龄CrPyr组肉鸡胸肌差异蛋白主要参与有机含氮化合物的代谢过程、小分子代谢过程、酮酸代谢、有机酸代谢、细胞发育、羧酸代谢等生物过程;主要参与细胞质、细胞质基质、胶原蛋白Ⅰ型等细胞组分;主要参与细胞外基质结构部组成、脂肪酸联结、ADP联结、乙酰乙酰辅酶A还原酶活性、tRNA转移酶活性等分子功能;基于KEGG数据库对3日龄肉鸡差异蛋白进行分析,主要与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路、肌纤维的紧密连接、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、丙酮酸代谢、AMPK信号通路、谷胱甘肽代谢等通路相关。综上所述,得出如下结论:(1)胚蛋注射12 mg的CrPyr可提高肉鸡42日龄的体重,改善肉鸡的生长性能。本试验条件下得出的CrPyr最适宜注射剂量为每枚种蛋12 mg。(2)胚蛋注射CrPyr提高了孵化后期鸡胚和雏鸡肝脏葡萄糖和糖原的浓度,这可能与提高了肝脏糖异生关键酶的活性、糖异生途径和糖原合成关键酶基因的表达,促进了肝脏的糖异生和糖原合成过程有关;注射CrPyr提高了胸肌肌酸和磷酸肌酸的浓度,增强了鸡胚和雏鸡胸肌的能量储备;注射CrPyr提高了出壳当天肉鸡胸肌葡萄糖转运载体的表达,促进了胸肌对血液葡萄糖的摄取,同时提高了糖酵解过程中关健酶的活性,促进了胸肌中的葡萄糖分解供能,这可能与高浓度的肌酸激活了肉鸡胸肌LKB1/AMPK信号通路有关。(3)胚蛋注射12 mg的CrPyr对42日龄肉鸡胸肌肉品质无显著影响,可提高胸肌重量和相对胸肌重量,促进肌肉发育。胚蛋注射CrPyr可上调雏鸡胸肌MRFs基因家族及Pax7基因的表达水平,抑制Myostatin基因的表达,提高3日龄肉鸡胸肌卫星细胞有丝分裂活性指数,促进卫星细胞的增殖和分化,这可能与肌酸激活了Wnt/β-catenin信号通路有关。(4)蛋白质组学分析发现,与空白对照组相比,CrPyr组肉鸡在出壳当天上调了胸肌中22种蛋白的表达,下调了 11种蛋白的表达;在3日龄上调了 11种蛋白的表达,下调了 9种蛋白的表达。通过GO分析和KEGG分析表明,胚蛋注射CrPyr主要通过调控ATP相关酶活性、调节碳水化合物代谢、脂代谢等过程,通过甲状腺激素信号通路和AMPK信号通路来影响机体的能量代谢过程。此外,胚蛋注射CrPyr可以通过影响肌纤维的发育、细胞增殖分化和蛋白质合成等过程来影响胸肌的发育过程。