论文部分内容阅读
目的：
化学疗法是临床肿瘤患者常用的治疗手段，治疗过程中产生的原发和继发耐药是肿瘤化疗失败的根本原因，克服耐药是提高肿瘤化疗效果的关键。MDR形成机制复杂，主要包括①由mdr1基因扩增而使其产物P糖蛋白(P-gp)过度生产；②谷胱甘肽(GSH)依赖性解毒酶系统活性增加；③DNA修复机制增强；④DNA拓扑异构酶含量减少或性质发生改变[1]。尽管MDR产生机制复杂,但由mdr1基因编码的P糖蛋白(Pglycoprotein，P-gp)的过表达是导致MDR的主要原因[2]。为了克服引起化疗失败的耐药现象，需要研制出适用于临床的低毒、高效的耐药逆转剂。由于植物所含的天然化合物具有来源广泛、价格低廉、毒性低等优点[3]，并且许多本身即有抗癌作用，因此中药逆转MDR具有潜在可行性。
灵芝为中国药典收载药材品种，在我国药用历史悠久，临床上常用于肿瘤的治疗或辅助治疗。研究发现灵芝三萜是其发挥抗肿瘤作用的主要有效成分之一[4]。灵芝三萜抗肿瘤作用确切，有良好的研究价值，但目前对于灵芝三萜逆转肿瘤多药耐药的作用研究较少，因此，从灵芝三萜分离纯化或通过再修饰，开发出高效、低毒能逆转肿瘤多药耐药的药物以供临床使用，是目前面临的任务和挑战。
方法：
乙醇回流提取得醇浸膏，再用系统溶剂提取法及酸碱处理获得灵芝三萜部位1。运用薄层色谱、硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和半制备高校液相色谱等手段对灵芝三萜部位1进行分离。用MTT法检测灵芝活性成分的抗肿瘤活性以及逆转MDR的效果，流式细胞仪（FCM）测定细胞内罗丹明123的蓄积量、胞内阿霉素的累积量，Realtime PCR以及WesternBlot检测mdr1基因和P-gp蛋白表达。
结果：
（1）提取灵芝总三萜成分进行分离得到三萜部位1，对三萜部位1采用两种分离方式进行分离纯化，方法1所得的活性部位，命名为GLT1-GLT10。方法1重现性差，在方法1的基础上进行改进即方法2，逐步进行分离，得到的活性部位命名为A1-A4、B1-B30、C、D；（2）MTT实验显示GLT-1对多个肿瘤细胞株均有较强的细胞毒作用：对K562、K562/A02、KB、KBv2000的IC50分别为13.00±1.33、12.76±0.35、6.20±0.83、5.38±1.09（μg/ml）；（3）GLT8、GLT-10以及B4-B8、B11-B18，它们本身细胞毒性小，逆转多药耐药的效果都强于VRP；（4）GLT-8以非细胞毒浓度5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml分别与ADR联合使用，对K562/A02的ADR耐药逆转倍数RF值分别为8.08、33.75、60.23（P?0.01），对KBv200的ADR耐药逆转倍数RF值分别为5.02、44.67、57.25，具有浓度依赖性。（3）GLT-8能增加罗丹明123在K562/A02细胞中的累积，而对相应敏感细胞株无影响。10μg/ml的GLT-8使Rh123累积量分别增加9.29倍，而作为阳性对照的P-gp抑制剂VRP为2.06倍，差异明显。（4）流式检测仪检测结果表明K562/A02细胞内的ADR荧光强度为1.7，加入GLT-8后细胞内ADR荧光强度增至69.4，累积量增加了41倍，差异显著（P?0.01），而同浓度VRP仅使荧光强度增至40.3，累积量增加了24倍，表明GLT-8对K562/A02细胞内ADR的累积作用强于VRP。（5）RT-PCR结果显示GLT-8对mdr1基因表达没有明显影响。（7）Western blot结果显示K562/A02细胞P-gp高表达，而在K562细胞中几乎没有表达，GLT-8对K562/A02细胞P-gp的表达几乎没有影响。
结论：
1.灵芝三萜有效部位GLT8、GLT-10以及B4-B8、B11-B18具有逆转K562/A02、KBv2000细胞对阿霉素耐药的作用。
2.GLT-8这种逆转作用可能与抑制P-gp蛋白的外排功能有关，与mdr1基因的表达以及P-gp蛋白的表达无关。
化学疗法是临床肿瘤患者常用的治疗手段，治疗过程中产生的原发和继发耐药是肿瘤化疗失败的根本原因，克服耐药是提高肿瘤化疗效果的关键。MDR形成机制复杂，主要包括①由mdr1基因扩增而使其产物P糖蛋白(P-gp)过度生产；②谷胱甘肽(GSH)依赖性解毒酶系统活性增加；③DNA修复机制增强；④DNA拓扑异构酶含量减少或性质发生改变[1]。尽管MDR产生机制复杂,但由mdr1基因编码的P糖蛋白(Pglycoprotein，P-gp)的过表达是导致MDR的主要原因[2]。为了克服引起化疗失败的耐药现象，需要研制出适用于临床的低毒、高效的耐药逆转剂。由于植物所含的天然化合物具有来源广泛、价格低廉、毒性低等优点[3]，并且许多本身即有抗癌作用，因此中药逆转MDR具有潜在可行性。
灵芝为中国药典收载药材品种，在我国药用历史悠久，临床上常用于肿瘤的治疗或辅助治疗。研究发现灵芝三萜是其发挥抗肿瘤作用的主要有效成分之一[4]。灵芝三萜抗肿瘤作用确切，有良好的研究价值，但目前对于灵芝三萜逆转肿瘤多药耐药的作用研究较少，因此，从灵芝三萜分离纯化或通过再修饰，开发出高效、低毒能逆转肿瘤多药耐药的药物以供临床使用，是目前面临的任务和挑战。
方法：
乙醇回流提取得醇浸膏，再用系统溶剂提取法及酸碱处理获得灵芝三萜部位1。运用薄层色谱、硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和半制备高校液相色谱等手段对灵芝三萜部位1进行分离。用MTT法检测灵芝活性成分的抗肿瘤活性以及逆转MDR的效果，流式细胞仪（FCM）测定细胞内罗丹明123的蓄积量、胞内阿霉素的累积量，Realtime PCR以及WesternBlot检测mdr1基因和P-gp蛋白表达。
结果：
（1）提取灵芝总三萜成分进行分离得到三萜部位1，对三萜部位1采用两种分离方式进行分离纯化，方法1所得的活性部位，命名为GLT1-GLT10。方法1重现性差，在方法1的基础上进行改进即方法2，逐步进行分离，得到的活性部位命名为A1-A4、B1-B30、C、D；（2）MTT实验显示GLT-1对多个肿瘤细胞株均有较强的细胞毒作用：对K562、K562/A02、KB、KBv2000的IC50分别为13.00±1.33、12.76±0.35、6.20±0.83、5.38±1.09（μg/ml）；（3）GLT8、GLT-10以及B4-B8、B11-B18，它们本身细胞毒性小，逆转多药耐药的效果都强于VRP；（4）GLT-8以非细胞毒浓度5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml分别与ADR联合使用，对K562/A02的ADR耐药逆转倍数RF值分别为8.08、33.75、60.23（P?0.01），对KBv200的ADR耐药逆转倍数RF值分别为5.02、44.67、57.25，具有浓度依赖性。（3）GLT-8能增加罗丹明123在K562/A02细胞中的累积，而对相应敏感细胞株无影响。10μg/ml的GLT-8使Rh123累积量分别增加9.29倍，而作为阳性对照的P-gp抑制剂VRP为2.06倍，差异明显。（4）流式检测仪检测结果表明K562/A02细胞内的ADR荧光强度为1.7，加入GLT-8后细胞内ADR荧光强度增至69.4，累积量增加了41倍，差异显著（P?0.01），而同浓度VRP仅使荧光强度增至40.3，累积量增加了24倍，表明GLT-8对K562/A02细胞内ADR的累积作用强于VRP。（5）RT-PCR结果显示GLT-8对mdr1基因表达没有明显影响。（7）Western blot结果显示K562/A02细胞P-gp高表达，而在K562细胞中几乎没有表达，GLT-8对K562/A02细胞P-gp的表达几乎没有影响。
结论：
1.灵芝三萜有效部位GLT8、GLT-10以及B4-B8、B11-B18具有逆转K562/A02、KBv2000细胞对阿霉素耐药的作用。
2.GLT-8这种逆转作用可能与抑制P-gp蛋白的外排功能有关，与mdr1基因的表达以及P-gp蛋白的表达无关。