基于RNA-Seq技术研究环境污染物对河蚬的毒性和毒理作用机制

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本研究以我国本土淡水底栖动物河蚬作为实验生物,建立了可用于水生态毒理学的河蚬生物毒性测试系统,包括河蚬的实验室驯养和养殖方法、河蚬毒性测试方法和RNA-Seq表达谱测试方法,并基于该方法对新型环境污染物药品和个人护理品(PPCPs)中的污染物卡马西平和氟西汀进行了毒性效应和作用机制研究。  对我国主要流域的河蚬分布进行了调查,选择洪泽湖河蚬,建立了河蚬实验室驯养和长期养殖的方法和规范,并对河蚬的实验室繁殖方法进行了初步摸索;利用第二代测序技术RNA-Seq首次对河蚬转录组进行了测序和生物信息学分析。测序共产生62,250,336高质量的reads,组装后获得134,684条转录本,平均长度为791 bp,并对这些转录本进行了生物信息学分析,包括基因功能注释、GO功能分类,KEGG信号通路注释,开放阅读框和SSRs鉴定等。选择具有注释信息并与毒理学研究相关的转录本,鉴定和克隆了河蚬抗氧化酶系统、ABC蛋白家族、细胞色素P450酶家族、神经系统和热休克蛋白家族等多条功能基因的片段。河蚬转录组的测序和分析丰富了河蚬的生物背景资料,为利用河蚬进行生物毒性测试提供了基础。  对卡马西平进行毒性效应评价和作用机制研究表明,卡马西平在环境浓度水平下对河蚬没有急性毒性,长期暴露能够抑制河蚬的虹吸行为和造成氧化损伤,造成亚慢性毒性。对卡马西平暴露后的河蚬内脏团进行RNA-Seq表达谱测序和分析,鉴定出9,821个差异表达转录本,对这些差异转录本进行GO功能KEGG信号通路富集分析,表明卡马西平主要影响河蚬甘氨酸代谢通路、药物代谢-细胞色素P450酶、谷胱甘肽代谢通路、细胞调亡和癌症相关等通路。结合基因定量指标重点研究了卡马西平对河蚬细胞应激反应系统的影响;卡马西平同时在转录水平和蛋白水平对河蚬热休克蛋白系统通路的调控具有干扰作用,造成了河蚬组织的分子损伤。这些结果同时证明所建立的河蚬生物毒性测试系统可适用于 PPCPs的毒性评价和毒性作用机制研究。  利用RNA-Seq技术,结合生长指标、行为学指标、生化指标、抗氧化系统和MXR系统相关基因表达,对氟西汀的毒性效应及其作用机制进行了多指标和多终点的研究,证明了氟西汀在环境浓度下对河蚬没有急性毒性;氟西汀对河蚬虹吸行为具有抑制作用,能够造成氧化损伤,对河蚬具有亚慢性毒性效应。对氟西汀暴露后的河蚬内脏团组织进行RNA-Seq表达谱测序和分析,鉴定出9,383个差异表达转录本,对这些差异转录本进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,表明氟西汀主要对河蚬酪氨酸代谢通路、细胞凋亡通路、细胞自噬作用通路、谷胱甘肽代谢、类固醇合成代谢通路和ABC跨膜蛋白通路等通路有影响;对河蚬MXR系统信号通路相关组分的进行分析,氟西汀暴露激活了河蚬细胞内解毒作用机制,同时抑制了ABC转运蛋白基因表达,造成了氟西汀在细胞内的聚集,产生了毒性效应。
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