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背景与目的
人类载脂蛋白E(Apolipoprotein E，apoE)是一个全长由299个氨基酸多肽链组成的血浆糖蛋白，主要用于转运胆固醇，甘油三脂，磷脂的过程。它有三种主要异构蛋白，apoE2，apoE3，apoE4，它们的主要差别就在于112位(TGC→CGC)与158位(CGC→TGC)氨基酸残基的半胱氨酸一精氨酸替换。这些异构蛋白的分子结构受定位于染色体区域19q13.2的APOE基因第四号外显子上三个独立共显性基因ε2，ε3，和ε4的调控。其中人群中最常见的是等位基因ε3，它的112位密码子编码半胱氨酸，158位密码子编码精氨酸，在人群中的频率大于70％；等位基因ε4相比ε3而言，则是在112位半胱氨酸密码子替换成了精氨酸，人群频率在10％左右；第三个等位基因ε2在112与158这两个位点上均编码半胱氨酸，人群频率一般小于10％。人类载脂蛋白E基因(APOE)有六种常见基因型，包括由任意两个等位基因构成的三种纯合子(ε2 ε2，ε3 ε3，ε4ε4)和三种杂合子(ε2ε3，ε2 ε4，ε3ε4)。
APOE基因是血浆脂蛋白水平变化的主要因素。APOE基因分型是诊断Ⅲ型高血脂症的参考依据，也是发生阿尔茨海默氏病和心血管疾病的重要风险因素之一，而且还是抗衰老和个体化用药研究的潜在研究靶点。APOE基因这两个已知多态性位点分型的方法迄今为止有限制性内切酶片断长度多态性法，单链构像多态性分析法，等位基因特异的寡核苷酸印记法，毛细管电泳检测法，实时荧光定量PCR分析法等，各有优缺点。一种准确快速的基因型分析方法对于任何有APOE临床研究需要和人群普查等广阔研究领域需要的实验室都是十分必要的。DHPLC就是一种快速、敏感、特异性好、稳定的方法，它可以用来检测已知突变和未知突变。该技术能够进行人群的大样本快速准确的筛查。我们跟据DHPLC这一平台建立了一种可以同时检测APOE两个多态性位点六种基因型的方法。设计与方法1．针对APOE基因以及17680159 T>C和17680297 C>T变异位点设计PCR扩增引物及优化PCR扩增条件。通过DNA测序获得APOE的各种基因型标准品。
2．建立检测APOE基因的PCR-DHPLC技术。利用经测序已知的基因型样品优化DHPLC分析的条件，运用DHPLC对样品PCR产物在半变性条件下进行分析，通过洗脱峰保留时间峰型和位置的差异区分不同基因型样品。由于部分纯合子样本PCR产物峰型和出峰时间相同，我们采取了按9：1的摩尔比混和待测样本与标准品的PCR产物，然后高温变性后缓慢复性，再运用DHPLC进行分析加以区分的方法。通过这一方法，我们可以同时区分APOE的六种基因型。
3．根据DHPLC的分析结果，从各种基因型中选取一定数量的样品进行测序分析，并与DHPLC结果对照，以证实该方法的准确性；应用方差分析对三周内三个批次的ε2ε2，ε3ε3，和ε4ε4纯合子洗脱峰的保留时间进行比对，并分析其变异系数，证实该方法的稳定性；同时随机分析了广州地区汉族人群APOE的基因频率和基因型频率，并应用x<2>检验确定该群体样本是否符合Hardy-Weinberg平衡。
结果与讨论
APOE基因的ε2ε2，ε3ε3，ε4ε4，ε2ε3，ε3ε4和ε2ε4这六种基因型能够在DHPLC上进行明显的区分。
1．用盲法分析对该方法进行评价，用此方法分析广州地区297份随机汉族人基因组DNA样品，从每种基因型中随机选出部分样品进行测序对照，结果符合率为100％，证实了该方法的准确性；对纯合子样品PCR产物洗脱峰的保留时间进行统计学分析，保留时间变异系数(CV)的范围从0.97％到1.05％，证实了该方法的稳定性。
2．该方法分析一个样品的六种基因型只需要10min，成本不足5元，与传统的检测方法相比，极大的提高了检测效率，降低了检测成本。
3．x<2>检验结果显示该所选群体符合Hardy-Weinberg平衡，APOE基因频率与文献报道的基本吻合，从另一方面说明了该方法的准确性。
评价结果表明，该方法能够快速，准确，低成本，自动化的检测APOE的基因型，为载脂蛋白E基因相关疾病的遗传学咨询、流行病学调查、研究APOE相关疾病发病风险的关系提供了一项常规检测手段。