【摘 要】
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以CRISPR-Cas9为代表的基因组编辑技术近年来迅速发展,在动、植物基因功能基础研究及基因治疗、分子育种实践中广泛应用。然而,植物基因组编辑基础及应用领域中,研究工作主要集中于水稻、玉米、番茄、拟南芥、烟草等重要农作物及模式植物中,而基于其他植物材料基因组结构及表达特性,针对性开发CRISPR-Cas9有效基因组编辑工具的研究工作十分有限,严重限制了这些植物材料中基于基因组编辑策略的基因功能研
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以CRISPR-Cas9为代表的基因组编辑技术近年来迅速发展,在动、植物基因功能基础研究及基因治疗、分子育种实践中广泛应用。然而,植物基因组编辑基础及应用领域中,研究工作主要集中于水稻、玉米、番茄、拟南芥、烟草等重要农作物及模式植物中,而基于其他植物材料基因组结构及表达特性,针对性开发CRISPR-Cas9有效基因组编辑工具的研究工作十分有限,严重限制了这些植物材料中基于基因组编辑策略的基因功能研究及种质创新应用。丹参、黄瓜分别是广泛应用的药用植物及蔬菜作物,也是次生代谢及果实发育研究中重要的模式植物材料,但现有基因组编辑相关研究十分有限,特别是没有针对性开发丹参及黄瓜CRISPR-Cas9基因组编辑工具,完全依靠拟南芥、番茄,甚至水稻中使用的CRISPR-Cas9基因组编辑工具,编辑效率、编辑特异性等核心编辑工具评价指标表现不佳,严重制约相关研究深入进行。基于此瓶颈问题,本学位论文在有效分析丹参、黄瓜基因组结构及表达特性的基础上,着力构建丹参、黄瓜有效CRISPR-Cas9基因组编辑工具,并对编辑活性、多位点编辑、编辑事件获得等进行定性、定量评价,以期为丹参、黄瓜进一步功能基因基础研究及分子育种应用实践提供有效、可行的基因组编辑工具。本学位论文主要研究结果如下:1、基于Cas9编辑系统核心元件不同组装策略,分别构建了多种类型双单元、单单元丹参Cas9基因组编辑骨架载体。基于丹参毛状根瞬时转化体系,确认双单元系统的编辑效率（77.5%）明显优于单单元系统（21.1%）。其中,以At Ubi10启动子驱动Cas9表达、At U6启动子驱动sg RNA表达的双单元骨架载体,编辑效率最优。同时,基于毛状根诱导T0再生苗策略,获得了丹参可靠编辑材料。2、在确认丹参双单元基因组编辑骨架载体基础上,对其多位点共编辑能力进行了测试。基于丹参毛状根瞬时转化结果表明,该系统在丹参4个内源基因多位点共编辑效率为:6.9%-44.8%。获得了三个基因同时敲除的根系,为后续丹参多基因共编辑突变体材料创制提供了可行借鉴。3、为了进一步提升转化子编辑事件获得效率,对At Ubi10启动子驱动Cas9表达、At U6启动子驱动sg RNA表达的双单元骨架载体进行升级构建:在Cas9表达单元下游融合2A元件连接的Hyg选择压单元;在sg RNA表达单元上游融合GFP-Poly A单元。升级后的双单元编辑骨架载体可以实现Cas9-Hyg及GFP-sg RNA的共表达,有效提升了阳性转化子中Cas9及sg RNA有效表达事件的比例,从而在丹参毛状根瞬时及叶盘法稳定转化中均提升了编辑效率。4、在有效构建丹参Cas9基因组编辑骨架载体基础上,使用前期分离鉴定的黄瓜高表达内源启动子Cs CRE02,有效提升Cas9与sg RNA的表达水平,并引入GRF4-GIF1植物促再生转录因子表达单元,以期探索基于Cas9、sg RNA表达效率及黄瓜转化再生效率两方面综合提升,实现黄瓜基因组编辑事件有效获得的可行性,为后续黄瓜基因组编辑工具开发及有效应用提供了有益借鉴。
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