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目的：构建VIM的干扰RNA真核表达载体,并且稳定转染人肝癌HepG2细胞,观察HepG2细胞的生长速率、凋亡以及侵袭转移能力的变化,探讨VIM在肝癌细胞这些过程中的作用,为肝癌发生、发展的研究及诊断与治疗提供有价值的资料。
方法:1.根据siRNA设计原则和GeneBank数据库中VIM的cDNA序列,构建4个VIM干扰RNA真核表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-VIM-SR90-1-3、pcDNATM6.2-GW/EmGFP-VIM-SP00-2-1、pcDNATM6.2-GW/EmGFP-VIM-SR90-3-2、pcDNATM6.2-GW/EmGFP-VIM-SR90-4-1,并测序鉴定。2.脂质体法分别将上述4个VIM干扰RNA真核表达载体转染到HepG2细胞株,杀稻瘟霉素筛选阳性转染细胞克隆,制备稳定转染4个VIM干扰RNA真核表达载体的HepG2细胞系。3.通过RT-PCR比较转染后VIM mRNA的表达量,选出干扰效果最好的一个。4.检测干扰效果最好的稳定转染细胞系的细胞生长曲线、侵袭转移能力的改变。
结果：(1).成功构建了VIM干扰RNA真核表达载体。经鉴定证实,构建的siRNAs序列与基因库中序列完全相同,并且未发现有突变、缺失、插入等异常存在。(2)获得稳定转染4个VIM干扰RNA真核表达载体和阴性对照载体的HepG2细胞系,分别命名为PVIM-1-HepG2、pVIM-2-HepG2、pVIM-3-HepG2、PVIM-4-HepG2、pNC-siRNA-HepG2细胞。(3).与阴性质粒组细胞和空白对照组细胞相比,稳定转染VIM RNAi组细胞的VIM mRNA表达水平显著下降。并且通过RT-PCR比较转染后VIM mRNA的表达量,选出PVIM-1-HepG2的干扰效果最好。(4).与转染阴性质粒组的PNC-siRNA-HepG2细胞和未转染组的HepG2细胞相比,pVIM-1-HepG2组细胞的生长速率减慢,凋亡增加,侵袭与转移能力减弱。
结论：(1)成功构建并筛选出了效果最好的VIM干扰RNA真核表达载体。(2).成功的建立稳定转染VIM干扰RNA的人肝癌HepG2细胞系。(3).VIM干扰RNA可明显降低HepG2细胞VIM mRNA的表达,抑制HepG2细胞的增殖。(4)VIM干扰RNA可明显增加HepG2细胞的凋亡。(5)VIM干扰RNA可明显降低HepG2细胞的侵袭转移的能力。